Time-lapse imaging di mitosi dopo la trasfezione di siRNA

I cambiamenti nell'organizzazione cellulare e nella dinamica cromosomica che si verificano durante la mitosi sono strettamente coordinati per garantire un'accurata ereditarietà del contenuto genomico e cellulare. In questo articolo video, viene mostrato un metodo per tracciare gli eventi caratteristici della mitosi. Il movimento cromosomico viene monitorato su base cellulare utilizzando linee cellulari che esprimono proteine marcate in fluorescenza.

La trasfezione con irna è diretta contro le proteine mitotiche, provoca cambiamenti del ciclo cellulare che possono essere visualizzati mediante imaging time-lapse e quantificati mediante analisi di immagini. Ciao, sono Douglas Mackey del laboratorio di Katie Oman presso l'Huntsman Cancer Institute dell'Università dello Utah. Oggi vi mostreremo una procedura per l'imaging delle cellule vive mentre progrediscono attraverso la mitosi dopo la trasfezione SIA.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare gli effetti che l'interruzione delle proteine di interesse può avere sui tempi della progressione mitotica. Quindi iniziamo. Preparare un vetro di copertura a quattro pareti lab tech a due camere aggiungendo 0,5 millilitri di fibronectina a ciascuna.

Incubare bene per 10-15 minuti a temperatura ambiente. Nel frattempo, preparare i complessi irna e lip RNAI max per la trasfezione inversa. Secondo le istruzioni del produttore per ogni camera, utilizzare bene la quantità consigliata per un pozzetto di una capsula da 24 pozzetti.

Dopo 15 minuti, rimuovere la fibronectina dai pozzetti del vetro di copertura a camera. Quindi aggiungere 100 microlitri di complessi di irna a ciascun pozzetto, aliquotare 20.000 cellule in 500 microlitri a ciascuna. Posizionare bene le cellule nell'incubatrice per 24 ore.

Il giorno successivo sostituire la miscela di trasfezione con un millilitro di normale terreno di coltura cellulare, quindi incubare le cellule altre 24 ore prima dell'acquisizione dell'immagine. La configurazione di acquisizione delle immagini consiste in un incubatore cellulare personalizzato che si adatta al tavolino di un microscopio invertito, controllato da un software di acquisizione delle immagini. Per prepararsi all'acquisizione dell'immagine, assicurarsi che l'incubatrice sia preavvertita ed equilibrata.

Quindi, aprire il coperchio dell'incubatore e posizionare le celle con il coperchio della camera nell'adattatore. Usa una piccola quantità di argilla da modellare per tenerlo in posizione. Chiudere il coperchio e posizionare l'intera incubatrice sul tavolino del microscopio, assicurandosi che l'incubatrice sia saldamente in posizione.

Successivamente, utilizzando metamorph, impostare l'esperimento selezionando l'acquisizione multidimensionale delle app nella barra dei menu del software. Verrà visualizzata una finestra in cui è possibile selezionare i parametri di imaging. Specificare la posizione in cui salvare i file di dati.

Quindi selezionare le lunghezze d'onda del campo chiaro e m cherry utilizzando l'obiettivo a contrasto di fase secca a quattro TX, mettere a fuoco un campo di celle utilizzando il software, regolare la funzione di messa a fuoco automatica solo per il canale Brightfield. Ciò consentirà al software di mettere a fuoco automaticamente in ogni posizione dello stadio prima di ogni acquisizione. Per la prima lunghezza d'onda, acquisire un'immagine Utilizzando un'esposizione di 50 millisecondi, regolare il tempo di esposizione al minimo necessario per vedere una buona immagine.

È essenziale limitare la quantità di esposizione alla luce per garantire una vitalità cellulare sostenuta. Come regola generale, il modo migliore per ottenere questo risultato è utilizzare un filtro a densità neutra e un tempo di esposizione della fotocamera più lungo. Piuttosto che aumentando la forza di illuminazione.

Ripetere questa procedura per eventuali lunghezze d'onda aggiuntive. Quindi impostare il tempo di esposizione per ciascun canale. Quindi, designare un intervallo di tempo di 15 minuti per otto ore in 15 posizioni di tappa.

Se si desidera una migliore risoluzione temporale, ridurre l'intervallo di tempo tra le acquisizioni. Ricorda che più posizioni sul palco vengono utilizzate, più tempo ci vorrà per acquisirle. Ad ogni intervallo di tempo, selezionare e contrassegnare un numero appropriato di posizioni dello stadio per campionare adeguatamente la popolazione cellulare.

Metamor registrerà le posizioni e tornerà alla posizione designata per ogni acquisizione. Dopo l'esposizione alla lunghezza d'onda del time lapse, sono state designate le informazioni sul tempo e sulla posizione dello stadio. Selezionare il pulsante di anteprima sullo schermo per confermare che il software stia controllando l'apparecchiatura in modo appropriato.

Dopo essersi assicurati che il sistema funzioni, selezionare il pulsante di acquisizione sullo schermo per iniziare l'acquisizione. Osservare l'automazione attraverso almeno un ciclo completo di acquisizione per assicurarsi che tutto funzioni correttamente. Quindi siediti e lascia che il computer e il microscopio facciano il lavoro.

Per esaminare i dati, selezionare le app, esaminare i dati multidimensionali nella barra dei menu, selezionare la visualizzazione della posizione del file, quindi selezionare una posizione in stage. Fare clic su carica immagini per rivedere la pila di immagini da quella posizione. Una volta caricate le immagini, utilizzare il mouse per avanzare tra i dati fotogramma per fotogramma.

Qui vengono generati filmati di cellule mitotiche utilizzando il metamorfo. Per creare un film in Metamorph, seleziona stack make movie. Nella barra dei menu, seleziona i fotogrammi da utilizzare, la velocità e il tipo di file del filmato.

Quindi selezionare Salva per creare un montaggio. Innanzitutto, salva i dati come file STK punto in metamorph. Quindi aprire l'immagine J Aprire il file dot s stk nell'immagine J e ritagliare una regione di interesse contrassegnando la regione e selezionando ritaglia immagine nella barra dei menu.

Quindi seleziona le pile di immagini. Fai in modo che il montaggio specifichi quali fotogrammi includere le dimensioni e la forma del montaggio. E se si desidera tra i bordi del fotogramma.

Quindi premi ok. Salvare il montaggio come file dot tiff. Infine, calcola il tempo in ogni stadio della mitosi, designando il sistema in cui il primo segno di condensazione del DNA o arrotondamento cellulare è evidente poiché T è uguale a zero profase.

La prometafase termina quando i cromosomi sono allineati all'equatore, la metafase procederà quindi fino a quando il DNA inizia a segregare la telofase di anafase. E infine, segue la citocinesi e le cellule iniziano ad appiattirsi. Imaging in time lapse delle cellule ilari che esprimono il suo calcolo.

H due BCFP è mostrato. Queste cellule sono state trasfettate con irna di controllo e progrediscono normalmente attraverso il ciclo cellulare. In confronto, le cellule che sono state trasfettate con siRNA diretti contro i pori nucleari NUP 1, 53 spostano gravi alterazioni nella progressione del MIT.

Vi abbiamo appena mostrato come impostare, eseguire e analizzare un esperimento di imaging time-lapse per determinare i tempi di progressione mitotica delle cellule dopo una trasfezione. Quando si esegue questa procedura, è importante essere il più delicati possibile con le cellule, mantenendo la temperatura e le concentrazioni di CO2 corrette e limitando la quantità di luce a cui le cellule sono esposte. Quindi questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.