Name: Time-lapse imaging di mitosi dopo la trasfezione di siRNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-06T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Impara a eseguire l'imaging time-lapse della mitosi in cellule di mammifero dopo trasfezione siRNA. Questo protocollo permette di quantificare la temporizzazione mitotica e analizzare la dinamica cromosomica in vivo.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla American Cancer Society (PF-07-103-01-CSM), il National Institutes of Health (R01 GM61275 e P30 CA042014), la Leukemia and Lymphoma Society, e la Huntsman Cancer Foundation.

trasfezione di siRNA e la preparazione delle cellule <ol><li> Preparare un 4-ben LabTek II coprioggetti incamerata con l&#39;aggiunta di 0,5 ml di fibronectina (10μg/mL) in ciascun pozzetto che verrà utilizzato. Incubare per 10-15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Preparare siRNA / Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) complessi di trasfezione inverso secondo le istruzioni del produttore s. Usare le quantità raccomandate di un pozzetto di un piatto ben 24 per camera da utilizzare (100μL totale). Un prodotto analogo / protocollo per la trasfezione di siRNA possono essere sostituiti. </li><li> Rimuovere la fibronectina dai pozzi del coprioggetti camerati. Aggiungere 100μL di siRNA / Lipofectamine complessi RNAiMAX in ogni pozzetto che verrà utilizzato. </li><li> Aliquota 20.000 istone H2B-mCherry cellule che esprimono (in 500μL) per pozzetto contenente miscela di trasfezione. </li><li> Consentono alle cellule ad incubare per ~ 24 ore prima della sostituzione miscela trasfezione con 1 ml di medium di coltura delle cellule normali. </li><li> Incubare cellule ulteriori 24 ore prima acquisizione delle immagini (48 ore post-trasfezione). </li></ol> Microscopio setup e acquisizione delle immagini <ol start="7"><li> Ci sono tre parti principali per la configurazione di acquisizione delle immagini: 1) una cella incubatore che si adatta in scena microscopio e mantiene un ambiente umido costante di 37 ° C, e il 5% di CO 2; 2) un microscopio invertito dotato di uno stadio automatizzato, automatizzato persiane fluorescenza e chiaro, e automatizzato ruote portafiltri e 3) un pacchetto software che integra e controlla il palco, persiane, e le ruote filtro. Nella nostra configurazione di imaging, si usa una cella personalizzata incubatore da OKO laboratorio che possono essere utilizzati con il II LabTek chambered coprioggetti. Il palco, persiane, e le ruote filtro sono controllate dal software Metamorph. Suggerimento: Il Laboratorio OKO stadio-top sistema incubatore comprende adattatori per una varietà di differenti piatto, piatto, o dimensioni coprioggetto. </li><li> Posizionare il LabTek II coprioggetti camerata in dell&#39;incubatore aprendo il coperchio del pre-riscaldato ed equilibrato incubatore, posizionando il coprioggetti camerata in l&#39;adattatore, e tenendo in posizione con plastilina. Lasciare il coperchio sul coprioggetti incamerata in modo che il terreno di coltura cellulare non si secchino. Chiudere il coperchio e posizionare il tutto incubatore sul palco microscopio, assicurando che l&#39;incubatore si tiene saldamente in posizione. </li><li> Utilizzando Metamorph, istituito l&#39;esperimento selezionando &quot;Applicazioni / Acquisizione multidimensionali&quot; nella barra dei menu del software. Si aprirà una finestra nella quale è possibile selezionare la frequenza e la lunghezza del Timelapse, il tempo di esposizione per ogni colore (se fare le regolazioni multiple), il numero e la localizzazione delle posizioni palco, e il numero di z-sezioni (se ) desiderata. . Scegliere dove salvare i file di dati Suggerimento: se usate un software diverso Metamorph, le funzioni possono essere leggermente diversi, ma il concetto generale è lo stesso. Micromanager, un open source ImageJ basato su software di acquisizione che è compatibile con gran parte delle configurazioni hardware, è un&#39;ottima alternativa. </li><li> . Ai fini di questo protocollo, che acquisirà le immagini a due lunghezze d&#39;onda (campo chiaro e mCherry) ogni 15 minuti per 8 ore a 15 posizioni fase Suggerimento: Se la risoluzione del momento migliore è desiderato, quindi si può ridurre l&#39;intervallo di tempo tra le acquisizioni, ma , le posizioni fase meno può essere utilizzato, e quindi un minor numero di cellule mitotiche saranno disponibili per l&#39;analisi. E &#39;importante quando si considera intervalli di tempo di prendere in considerazione il tempo necessario per la ruota filtro per passare da un set di filtri. </li><li> Determinare il momento ottimale di esposizione per ogni lunghezza d&#39;onda dapprima concentrandosi su un campo di cellule con illuminazione campo chiaro. Nel software, regolare la funzione di messa a fuoco automatica solo per il channel campo chiaro (questo permetterà al software di messa a fuoco automatica ad ogni posizione stadio prima di ogni acquisto). Suggerimento: Si utilizza un 40x a contrasto di fase obiettivo di dare resolution eccellente senza la necessità di petrolio . Altri obiettivi possono essere utilizzati a seconda della risoluzione ottica desiderata. </li><li> Passare alla lunghezza d&#39;onda mCherry e scattare un&#39;immagine utilizzando un 50 esposizione msec. Regolare il tempo di esposizione al minimo indispensabile per vedere una buona immagine. È essenziale per limitare la quantità di esposizione alla luce per garantire la vitalità delle cellule sostenuta. Come regola generale, questo può essere realizzato utilizzando un filtro a densità neutra (per ridurre il flusso luminoso eccitazione) e più a lungo un tempo di esposizione della fotocamera, piuttosto che aumentando la resistenza illuminazione. Ripetere questa procedura per ogni lunghezza d&#39;onda aggiuntive da utilizzare. Suggerimento: Per determinare la redditività a lungo termine delle cellule in una data esposizione per l&#39;esperimento, è possibile visualizzare in anteprima il numero totale di immagini una cella può sopravvivere a Timelapse desiderato modificando temporaneamente la spaziatura timepoint da minuti a secondi (cioè, 10 min. diventa 10 secondi). Se le cellule sopravvivono 100-200 esposizioni (o ilnumero appropriato), quindi l&#39;esposizione è bene. In caso contrario, ridurre la luce di eccitazione, tempo di esposizione, o il numero totale di immagini per simulare l&#39;esperimento completo. </li><li> Poi, selezionare e segnare un numero adeguato di posizioni fase in modo che si può ottenere adeguato campionamento della popolazione di cellule. Metamorph registrerà le posizioni e farvi ritorno per ogni acquisizione. Suggerimento: io in genere cercano di trovare posizioni in cui ci sono molte cellule di immagine, ma non così tanti che sono troppo densi. Inoltre, è importante scegliere posizioni abbastanza in modo che si hanno buone possibilità di osservare un gran numero di cellule progredendo attraverso la mitosi. </li><li> Dopo tutto Timelapse, tempo di esposizione lunghezza d&#39;onda, e la posizione informazione fase sono stati registrati, selezionare il pulsante &quot;Anteprima&quot; sullo schermo per determinare se il software è il controllo delle attrezzature in modo appropriato. </li><li> Una volta soddisfatti, selezionare il pulsante &quot;Acquisisci&quot; sullo schermo per iniziare l&#39;acquisizione. Poi sedersi e consentire al computer e il microscopio per fare il lavoro. Suggerimento: Osservare l&#39;automazione attraverso almeno un giro completo di acquisizione per garantire che tutto funzioni correttamente. </li></ol> Elaborazione delle immagini e analisi <ol start="16"><li> Dopo l&#39;acquisizione è terminata, il passo successivo è quello di trasferire i dati immagine in una forma che è più facile da gestire. Ai fini di questo protocollo, voglio dimostrare prima come generare filmati utilizzando Metamorph, poi come generare montaggi immagine utilizzando il programma ImageJ. Sia in formato sarà utile ai fini di quantificazione. </li><li> Il primo passo è quello di rivedere i dati. Per farlo, selezionare &quot;Applicazioni / Rassegna dati multidimensionali&quot; nella barra dei menu. Selezionare la posizione del file, quindi selezionare &quot;View&quot;. Questo vi permetterà di rivedere la pila di immagini da ogni posizione stadio individualmente. Selezionare la posizione di fase desiderata, quindi &quot;Carica Immagini&quot;. Sarete in grado di avanzare attraverso i dati fotogramma per fotogramma. </li><li> Per quelle posizioni fase in cui le cellule passano attraverso la mitosi (come determinato da entrambi i DNA e morfologia cellulare), è possibile realizzare filmati e montaggi utilizzando Metamorph, o con altri programmi come ImageJ (disponibile gratuitamente attraverso NIH). </li><li> Per fare un film in Metamorph, selezionare &quot;Processo / Save film&quot; nella barra dei menu. Sarete in grado di selezionare i fotogrammi da utilizzare, la velocità e il tipo di file del film. Quindi selezionare &quot;Salva filmato&quot;. </li><li> Per fare un montaggio, risparmio il serie di immagini come file. Stk, che possono essere utilizzati in altri programmi come ImageJ. </li><li> Aprire il file in ImageJ e far avanzare i telai fino a trovare una cellula passa attraverso la mitosi. . Raccolto l&#39;area intorno alla cella e selezionare &quot;Immagine / Duplica&quot; Suggerimento: assicurarsi di duplicare tutti i fotogrammi. </li><li> Per fare un montaggio, selezionare &quot;Immagine / stack / Fai Montage&quot;, nella barra dei menu. Qui è possibile specificare quali fotogrammi che si desidera includere, la dimensione e la forma del montaggio, e se si desidera confini tra i fotogrammi. Selezionare queste e clicca su &quot;Ok&quot;. .. Salvare il montaggio come file tif e fare ogni ulteriore elaborazione sia in ImageJ o Adobe Photoshop Suggerimento: Modificare i file di montaggio da 16-bit formato utilizzato da Metamorph a 8-bit per l&#39;elaborazione delle immagini più facile. </li><li> Per calcolare il tempo in diverse fasi della mitosi, determinare t = 0 (primo segno di condensa DNA o arrotondamento delle cellule), contare il numero di fotogrammi fino cromosomi si allineano all&#39;equatore (tempo in profase / prometafase), cornici fino cromosomi cominciano a segregare (tempo in metafase), e le cornici fino cellule cominciano ad appiattirsi (anafase / telofase / citodieresi). Il tempo calcolato in ogni fase mitotica dipende dall&#39;intervallo di tempo tra ogni fotogramma. </li></ol> Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/1878/1878fig1tmb.jpg" border="0" /> La figura 1 illustra i risultati di un tipico esperimento di trasfezione di siRNA di controllo utilizzando una linea cellulare HeLa che esprimono istone H2B-mCherry. Questo metodo di è stato effettivamente utilizzato per quantificare tempi mitotica, rivelando un ruolo inaspettato per la nucleoporin Nup153 nei tempi della tarda mitosi 1. Si prega di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1878/1878fig1.jpg">cliccare qui</a> per vedere una versione più grande della figura 1.

<ol><li>Mackay, D. R., Elgort, S. W., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleoporin+Nup153+has+separable+roles+in+both+early+mitotic+progression+and+the+resolution+of+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The nucleoporin Nup153 has separable roles in both early mitotic progression and the resolution of mitosis.</a> Mol Biol Cell. 20, 1652-1660 (2009).</li>
<li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38, 2-16 (2006).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Meraldi, P., Draviam, V. M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+and+checkpoints+in+the+regulation+of+mitotic+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Timing and checkpoints in the regulation of mitotic progression.</a> Dev Cell. 7, 45-60 (2004).</li>
<li>Mora-Bermudez, F., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+structural+dynamics+of+chromosomes+in+living+cells+by+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Measuring structural dynamics of chromosomes in living cells by fluorescence microscopy.</a> Methods. 41, 158-167 (2007).</li>
<li>Prosser, S. L., Fry, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+the+centrosome+cycle+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of the centrosome cycle in mammalian cells.</a> Methods Mol Biol. 545, 165-183 (2009).</li>
<li>Malureanu, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BubR1+N+terminus+acts+as+a+soluble+inhibitor+of+cyclin+B+degradation+by+APC%2FC%28Cdc20%29+in+interphase%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">BubR1 N terminus acts as a soluble inhibitor of cyclin B degradation by APC/C(Cdc20) in interphase.</a> Dev Cell. 16, 118-131 (2009).</li>
<li>Anderson, D. J., Hetzer, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reshaping+of+the+endoplasmic+reticulum+limits+the+rate+for+nuclear+envelope+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reshaping of the endoplasmic reticulum limits the rate for nuclear envelope formation.</a> J Cell Biol. 182, 911-924 (2008).</li>
<li>Beaudouin, J., Gerlich, D., Daigle, N., Eils, R., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+envelope+breakdown+proceeds+by+microtubule-induced+tearing+of+the+lamina%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear envelope breakdown proceeds by microtubule-induced tearing of the lamina.</a> Cell. 108, 83-96 (2002).</li>
<li>Marcus, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+spindle+behavior+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Visualization of spindle behavior using confocal microscopy.</a> Methods Mol Med. 137, 125-137 (2007).</li>
<li>Steigemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora+B-mediated+abscission+checkpoint+protects+against+tetraploidization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Aurora B-mediated abscission checkpoint protects against tetraploidization.</a> Cell. 136, 473-484 (2009).</li>
<li>Draviam, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+genomic+screen+identifies+a+role+for+TAO1+kinase+in+spindle-checkpoint+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A functional genomic screen identifies a role for TAO1 kinase in spindle-checkpoint signalling.</a> Nat Cell Biol. 9, 556-564 (2007).</li>
<li>Neumann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+RNAi+screening+by+time-lapse+imaging+of+live+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput RNAi screening by time-lapse imaging of live human cells.</a> Nat Methods. 3, 385-390 (2006).</li>
<li>Stegmeier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaphase+initiation+is+regulated+by+antagonistic+ubiquitination+and+deubiquitination+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Anaphase initiation is regulated by antagonistic ubiquitination and deubiquitination activities.</a> Nature. 446, 876-881 (2007).</li>
</ol>

Con i recenti progressi nel campo dell&#39;imaging e della tecnologia proteina fluorescente, immagini dal vivo è diventato un aspetto di routine di analisi cellulare 2. Una varietà di GFP (e altre varianti di colore 3)-tagged proteine ​​sono ampiamente disponibili e relativamente facile da realizzare e può essere usato per tenere traccia di un certo numero di caratteristiche tra cui la divisione cellulare DNA / dinamiche cromosoma 4, 5, centrosoma duplicazione 6, ciclina dinamiche B 7, ripartizione involucro nucleare e rimontaggio 8, 9, fuso mitotico formazione di 10, e varie fasi di citocinesi 11. Proteine ​​tag possono essere usati da soli o in combinazione, quando l&#39;eccitazione / emissione spettri di tag fluorescenti sono compatibili, permettendo il coordinamento tra gli eventi specifici da valutare. Se la risoluzione spaziale maggiore e / o temporale è / sono desiderati, se microscopia confocale a scansione laser scanning, disco rotante, o risonanza può essere utilizzata, e l&#39;elenco delle opzioni di microscopia sofisticate con sempre maggiore risoluzione continua a crescere. Immagini dal vivo della mitosi nelle cellule di mammifero è stato adattato per l&#39;uso in high-throughput RNAi e gli schermi di piccole molecole 12-14. Così, mentre gli esperimenti iniziale di un s utilizzando questa tecnica può essere relativamente semplice, le possibilità di costruire su questa strategia sono molteplici.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778-075</td><td></td></tr><tr><td>Lab Tek II Chambered Coverglass (4 pozzetti)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>12-565-337</td><td>Sono disponibili dimensioni aggiuntive delle camere</td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore cellulare per palco microscopico</td><td>OKO Lab</td><td></td><td>È possibile utilizzare qualsiasi camera appropriata</td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza invertito automatizzato</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>È possibile utilizzare qualsiasi microscopio appropriato</td></tr><tr><td>Pacchetto software</td><td>Metamorph</td><td></td><td>È possibile utilizzare qualsiasi software appropriato</td></tr></tbody></table>

time-lapse imaging di mitosi dopo la trasfezione di sirna

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Cambiamenti nell&#39;organizzazione del cellulare e della dinamica dei cromosomi che si verificano durante la mitosi sono strettamente coordinato per garantire eredità accurata del contenuto genomica e cellulare. Hallmark eventi della mitosi, come il movimento dei cromosomi, può essere facilmente monitorati su base singola cella utilizzando time-lapse microscopia a fluorescenza di linee cellulari di mammiferi che esprimono specifiche proteine ​​GFP-tagged. In combinazione con base di RNAi esaurimento, questo può essere un metodo efficace per individuare la fase di (s) della mitosi in cui i difetti si verificano dopo i livelli di una proteina particolare sono stati abbassati. In questo protocollo, vi presentiamo un metodo di base per valutare l&#39;effetto di impoverire una proteina potenziale mitotico regolamentazione sui tempi della mitosi. Le cellule sono transfettate con siRNA, posto in un palco-top camera di incubazione, e fotografato con un microscopio a fluorescenza automatizzato. Abbiamo descritto come utilizzare il software per impostare un time-lapse experiment, come elaborare il sequenze di immagini per dare sia di immagini fisse montaggi o film, e come quantificare e analizzare i tempi di stadi mitotico si usa una cella-line expressing mCherry- tag istone H2B. Infine, si discute considerazioni importanti per la progettazione di un time-lapse esperimento. Questa strategia è complementare ad altri approcci e offre i vantaggi di 1) sensibilità ai cambiamenti di cinetica che potrebbe non essere osservati quando si guarda cellule come una popolazione e 2) l&#39;analisi della mitosi, senza la necessità di sincronizzare il ciclo cellulare con trattamenti farmacologici. Le informazioni visive dagli esperimenti di imaging, non solo permette la sub-fasi della mitosi da valutare, ma può anche fornire indicazioni inaspettati che non sarebbe evidente dall&#39;analisi del ciclo cellulare da FACS.

Qui si descrive un protocollo di base per l&#39;immagine e quantificare i tempi mitotico delle cellule dei tessuti dei mammiferi vivono cultura dopo trasfezione di siRNA.

Time-lapse imaging di mitosi dopo la trasfezione di siRNA

Le variazioni nell'organizzazione cellulare e nella dinamica cromosomica che si verificano durante la mitosi sono strettamente coordinate per garantire l'ereditarietà accurata del genoma e...

I cambiamenti nell'organizzazione cellulare e nella dinamica dei cromosomi che avvengono durante la mitosi sono strettamente coordinati per garantire un'ereditarietà accurata del contenuto genomico e cellulare. In questo articolo video, viene illustrato un metodo per tracciare gli eventi distintivi della mitosi. Il movimento dei cromosomi viene monitorato su base cellulare individuale utilizzando linee cellulari che esprimono proteine marcate con fluorescenza.La trasfezione con irna diretta contro le proteine mitotiche provoca modifiche del ciclo cellulare che possono essere visualizzate mediante imaging in time-lapse e quantificate tramite analisi delle immagini. Ciao, sono Douglas Mackey del laboratorio di Katie Oman presso l'Huntsman Cancer Institute dell'Università dello Utah. Oggi vi mostreremo un procedimento per l'imaging di cellule vive mentre progrediscono attraverso la mitosi dopo la trasfezione con SIA.Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare gli effetti che l'interruzione delle proteine di interesse può avere sui tempi di progressione mitotica. Cominciamo dunque. Preparare una piastrina coprioggetto con quattro pareti e due camere aggiungendo 0,5 millilitri di fibronectina a ciascuna.Incubare bene per 10-15 minuti a temperatura ambiente. Nel frattempo, preparare i complessi irna e lip RNAI max per la trasfezione inversa. In base alle istruzioni del produttore per ogni camera, utilizzare la quantità raccomandata per un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti.Dopo 15 minuti, rimuovere la fibronectina dalle pozzette della camera con coprivetrino. Quindi aggiungere 100 microlitri di complessi irna in ogni pozzetta, aliquotando 20.000 cellule in 500 microlitri per ciascuna. Collocare le cellule nell'incubatrice per 24 ore.Il giorno successivo, sostituire la miscela di trasfezione con un millilitro di mezzo di coltura cellulare normale, quindi incubare le cellule per ulteriori 24 ore prima dell'acquisizione delle immagini. La configurazione per l'acquisizione delle immagini è costituita da un incubatore cellulare personalizzato che si adatta al piano di un microscopio invertito, il quale è controllato da un software per l'acquisizione delle immagini. Per prepararsi all'acquisizione delle immagini, assicurarsi che l'incubatore sia stato preriscaldato ed equilibrato.Successivamente, aprire il coperchio dell'incubatore e posizionare le cellule con il coperchio della camera nell'adattatore. Utilizzare una piccola quantità di argilla modellabile per mantenerlo in posizione. Chiudere il coperchio e posizionare l'intero incubatore sul palchetto del microscopio, assicurandosi che l'incubatore sia ben fissato. Successivamente, utilizzando Metamorph, configurare l'esperimento selezionando l'opzione "acquisizione multidimensionale" nella barra dei menu del software. Verrà visualizzata una finestra in cui è possibile selezionare i parametri di acquisizione delle immagini. Specificare la posizione in cui salvare i file dei dati.Quindi selezionare le lunghezze d'onda in campo chiaro e mCherry utilizzando l'obiettivo a contrasto di fase secco da 4 TX, mettere a fuoco un campo di cellule mediante il software e regolare la funzione di messa a fuoco automatica solo per il canale in campo chiaro. Questo permetterà al software di effettuare automaticamente la messa a fuoco in ogni posizione prima di ogni acquisizione. Per la prima lunghezza d'onda, acquisire un'immagine con un tempo di esposizione di 50 millisecondi, quindi regolare il tempo di esposizione al minimo necessario per ottenere un'immagine di buona qualità.È essenziale limitare l'esposizione alla luce per garantire la viabilità cellulare prolungata. Come regola generale, ciò può essere ottenuto al meglio utilizzando un filtro neutro di densità e un tempo di esposizione della fotocamera più lungo, piuttosto che aumentando l'intensità dell'illuminazione.Ripetere questa procedura per tutte le lunghezze d'onda aggiuntive. Quindi impostare il tempo di esposizione per ogni canale. Successivamente, impostare un intervallo di acquisizione temporale di 15 minuti per otto ore in 15 posizioni della piastra.Se si desidera una risoluzione temporale migliore, accorciare l'intervallo di tempo tra le acquisizioni. Ricordare che più posizioni della piastra vengono utilizzate, più tempo sarà necessario per l'acquisizione. A ogni intervallo di tempo, selezionare e contrassegnare un numero adeguato di posizioni della piastra per campionare in modo appropriato la popolazione cellulare.Metamor registrerà le posizioni e tornerà al punto designato per ogni acquisizione. Dopo l'esposizione con intervallo temporale alla lunghezza d'onda, sono stati definiti il tempo e le informazioni sulla posizione del palchetto. Selezionare il pulsante di anteprima sullo schermo per verificare che il software stia controllando correttamente l'apparecchiatura.Dopo aver verificato che il sistema sia funzionante, selezionare il pulsante di acquisizione sullo schermo per iniziare l'acquisizione. Osservare l'automazione per almeno un ciclo completo di acquisizione per assicurarsi che tutto funzioni correttamente. Successivamente, appoggiarsi e lasciare che il computer e il microscopio svolgano il lavoro.Per esaminare i dati, selezionare applicazioni, esaminare dati multidimensionali nella barra del menu, selezionare la visualizzazione della posizione del palco, quindi selezionare una posizione del palco. Fare clic su carica immagini per esaminare la serie di immagini provenienti da quella posizione. Una volta caricate le immagini, utilizzare il mouse per avanzare nei dati quadro per quadro.Qui vengono generati filmati di cellule mitotiche utilizzando Metamorph. Per creare un filmato in Metamorph, selezionare "Stack" e poi "Make Movie". Nella barra dei menu, selezionare quali fotogrammi utilizzare, la velocità e il tipo di file del filmato.Quindi selezionare salva per creare un montaggio. Prima, salvare i dati come file STK puntato in Metamorph. Poi aprire ImageJ, aprire il file STK puntato in ImageJ e ritagliare una regione di interesse delimitando la regione e selezionando Immagine → Ritaglia nella barra del menu.Quindi selezionare gli stack di immagini. Creare un montaggio specificando quali fotogrammi includere, le dimensioni e la forma del montaggio, e se si desiderano bordi tra i fotogrammi.Quindi premere OK. Salvare il montaggio come file TIFF. Infine, calcolare il tempo trascorso in ogni fase della mitosi, definendo il fotogramma in cui è evidente il primo segno di condensazione del DNA o di arrotondamento cellulare come T uguale a zero, profase.La prometafase termina quando i cromosomi si allineano all'equatore; la metafase prosegue quindi fino a quando il DNA inizia a segregarsi, anafase e telofase. Infine, segue la citocinesi e le cellule iniziano ad appiattirsi. Imaging a intervalli di tempo di cellule ilari che esprimono his stone.È mostrato H two BCFP. Queste cellule sono state trasfettate con irna di controllo e procedono normalmente attraverso il ciclo cellulare. Al contrario, le cellule trasfettate con siRNA diretti contro il porina nucleare NUP 153 mostrano gravi alterazioni nella progressione della MIT.Abbiamo appena mostrato come impostare, eseguire e analizzare un esperimento di imaging a intervalli per determinare i tempi di progressione mitotica delle cellule dopo la transfezione con sir. Quando si esegue questa procedura, è importante essere il più delicati possibile con le cellule, mantenendo la temperatura e le concentrazioni di CO2 appropriate e limitando l'esposizione alla luce. È tutto.Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Formazione immagine della vivere-cella fornisce una ricchezza di informazioni su singole cellule o di intere popolazioni che è irraggiungibile da cella fissa imaging da solo. Qui, i protocolli di imaging di cellule vive per valutare le decisioni di destino delle cellule dopo il trattamento con il paclitaxel della droga anti-mitotico sono descritti.

A lungo termine Live cell Imaging per valutare il destino delle cellule in risposta a Paclitaxel

Le divisioni cellulari possono essere visualizzate in tempo reale utilizzando proteine fluorescenti e microscopia time-lapse. Utilizzando il protocollo qui presentato, gli utenti possono analizzare le dinamiche di temporizzazione della divisione cellulare, l'assemblaggio del mandrino mitotico e il congresso cromosomico e la segregazione. I difetti in questi eventi a seguito del knockdown genico mediato dall'RNA (RNAi) possono essere valutati e quantificati.

Uso di celle Drosophila S2 per l'imaging live della divisione cellulare

Qui presentiamo un protocollo per valutare la dinamica della formazione del mandrino e della progressione mitotica. La nostra applicazione di imaging time-lapse consente all'utente di identificare le cellule in varie fasi della mitosi, monitorare e identificare i difetti mitotici e analizzare la dinamica del mandrino e il destino delle cellule mitotiche dopo l'esposizione a farmaci anti-mitotici.

Live Cell Imaging per valutare la dinamica della temporizzazione metafase e del destino delle cellule a seguito di perturbazioni mitotiche del mandrino

Presentiamo un metodo per l'acquisizione di corsi di tempo reporter a fluorescenza da singole cellule utilizzando array micropatterned. Il protocollo descrive la preparazione di array a cella singola, la configurazione e il funzionamento della microscopia time-lapse di scansione a celle vive e uno strumento di analisi delle immagini open source per la preselezione automatizzata, il controllo visivo e il tracciamento dei corsi di tempo di fluorescenza integrati nelle celle per sito di adesione.

Imaging a cellule vive di array a cella singola (LISCA) - una tecnica versatile per quantificare la cinetica cellulare

Questo protocollo illustra un sistema di dimerizzazione proteica indotto chimicamente per creare condensati sulla cromatina.  Viene dimostrata la formazione del corpo nucleare della leucemia promielocitica (PML) sui telomeri con dimerizzatori chimici. La crescita, la dissoluzione, la localizzazione e la composizione delle goccioline sono monitorate con imaging di cellule vive, immunofluorescenza (IF) e ibridazione fluorescente in situ (FISH).

Condensati proteici indotti da dimerizzazione chimica sui telomeri

Questo protocollo presenta un nuovo sistema genico reporter e la configurazione sperimentale per rilevare la trascrizione a rotture a doppio filamento di DNA con sensibilità a singola molecola.

Imaging a cellule vive dell'attività trascrizionale a rotture a doppio filamento di DNA

La microscopia time-lapse è uno strumento prezioso per studiare la meiosi nel lievito in erba. Questo protocollo descrive un metodo che combina la sincronizzazione del ciclo cellulare, la microscopia time-lapse e l'esaurimento condizionale di una proteina bersaglio per dimostrare come studiare la funzione di una proteina specifica durante la segregazione cromosomica meiotica.

Uso della microscopia time-lapse e della deplezione nucleare stadio-specifica delle proteine per studiare la meiosi in S. cerevisiae

Impara a eseguire l'imaging time-lapse della mitosi in cellule di mammifero dopo trasfezione siRNA. Questo protocollo permette di quantificare la temporizzazione mitotica e analizzare la dinamica cromosomica in vivo.

Time-lapse imaging di mitosi dopo la trasfezione di siRNA

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