Name: Incorporare plastica e Sezionamento embrioni di Xenopus laevis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 39 s
Description: Impara a preparare sezioni in plastica di embrioni di Xenopus laevis per studi di immunofluorescenza ad alta risoluzione. Questa tecnica preserva la morfologia tissutale e migliora la qualità delle immagini rispetto ai metodi tradizionali.

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Fissazione <ol><li> Trasferimento degli embrioni intero o sezionato in espianti MEMFA o 3,7% FA + PBS in una piccola fiala di vetro scintillazione (cat Fisher # 03-339-25B). Incubare fiala sul nutator a temperatura ambiente, solo per 2 ore, e non di più. Non lasciare l&#39;embrione in FA per più di 2 ore. Più a lungo di incubazione in FA renderà più difficile il tessuto embrionale e determinare una scarsa penetrazione di anticorpi nel processo di rilevamento. </li><li> Aspirare la maggior parte delle FA e aggiungere fissativo Dent fino alla cima del flaconcino (~ 4,5 ml). Capovolgere delicatamente il flaconcino per un paio di volte per lavare gli embrioni a Dent, lo scambio con un altro di 4,5 ml di Dent fresca, e incubare in -20 ° C per almeno 48 ore. Durante la notte non è sufficiente. Questo passo rende gli embrioni più permeabile per l&#39;anticorpo. Gli embrioni possono essere mantenute in questo stato per diverse settimane. </li></ol> Immunofluorescenza <ol><li> Reidratare il campione. Incubare in una serie graduata di metanolo, come segue: <table style="width: 171px; height: 119px;" border="0" cellpadding="3"><tbody><tr><td> 75% MeOH / H 2 O </td><td> 10min </td></tr><tr><td> 50% MeOH / PBS </td><td> 10min </td></tr><tr><td> 25% MeOH / PBS </td><td> 10min </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 10min </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 10min </td></tr></tbody></table> </li><li> Fai agarosio 1,5% / PBS piastre con 60 millimetri piatti di plastica. Versare PBS in cima alla agarosio dopo è diventato solido. </li><li> Emi-sezionamento degli embrioni: Mettere gli embrioni in un 1,5% di agarosio / PBS piatto. Afferra un embrione con un paio di pinze e tagliare a metà il centro di un embrione con una lama sottile di rasoio. Scegli quelli che sei riuscito a tagliare a metà con un piano di taglio dritto. <img src="/files/ftp_upload/old/188_2008_7_10_3/188_figure-01.jpg" alt="Figura 1" width="591" height="193" /> </li><li> Trasferimento degli embrioni divisa in due in un flaconcino di vetro scintillazione con PBT. Scambio con 4,5 ml di siero di capra 20% + PBT. Incubare a RT per 2 ore su una nutator (blocco). </li><li> Preparare una diluizione appropriata di anticorpi primari in PBT. 0,5 ml di campioni per questo è necessario. Per esempio, ho usato la diluizione 1 / 200 di coniglio anti-C-caderina pab per studiare la localizzazione subcellulare di C-caderina nelle sezioni 5 millimetri di plastica. </li><li> Aspirare la soluzione di saturazione e aggiungere 0,5 ml di anticorpo primario diluito. Mettere le fiale in posizione di stand-up su un supporto tubo di polistirolo. Incubare per una notte a 4 ° C su un nutator. </li><li> Rimuovere l&#39;anticorpo primario diluito (questo anticorpo primario diluito possono essere salvate e riutilizzate nelle prossime 1-2 settimane). Lavare con 4,5 ml di PBT per 4 volte (40-60 minuti) a temperatura ambiente. </li><li> Scambio con 0,5 ml di diluizione 1 / 100 di biotina-anticorpo secondario coniugato in PBT. Incubare per una notte a 4 ° C su un nutator. Coprire le provette con un foglio di alluminio per proteggere dalla luce biotina. </li><li> Da questo punto, occorre prestare attenzione per proteggere il campione dalla luce, cioè, tenere i flaconi sotto qualche coperchio o foglio di alluminio. </li><li> Rimuovere la biotina-anticorpo secondario (questo può essere anche riutilizzato nei prossimi 1-2 settimane). Lavare con o 4,5 ml di PBT per 4 volte (40-60 minuti) a temperatura ambiente. </li><li> Scambio con 0,5 ml di 1 / 200 di diluizione di fluorescenza marcata (FITC, Texas-rosso, ecc) streptavidina in PBT. Incubare per una notte a 4 ° C su un nutator. </li><li> Rimuovere la streptavidina (questo può essere riutilizzato, anche). Lavare con 4,5 ml di PBT per 3 volte (15 - 30 minuti ciascuno) a temperatura ambiente. </li><li> Fissare gli embrioni in 4,5 ml del 3,7% FA + PBS per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare con 4,5 ml di PBS due volte. </li><li> Disidratare il campione. Incubare in una serie graduata di etanolo, come segue: <table style="width: 172px; height: 80px;" border="0"><tbody><tr><td> 30% EtOH / H 2 O </td><td> 10 min </td></tr><tr><td> 50% EtOH / H 2 O </td><td> 10 min </td></tr><tr><td> 75% EtOH / H 2 O </td><td> 10 min </td></tr><tr><td> 100% EtOH </td><td> 10 min </td></tr></tbody></table> </li><li> Il campione può essere conservato in EtOH 100% a 4 ° C con un coperchio per proteggerlo dalla luce. </li></ol> Infiltrazione <ol><li> Fai Technovit 7100 mix infiltrazione. Di solito prendo 15 ml di liquido di base in un tubo da 50 ml conica, aggiungere 150 mg di I e indurente da mescolare a dondolo su un nutator per 15 minuti. Questo mix infiltrazione può essere conservato a 4 ° C per un massimo di un mese. </li><li> Infiltrarsi nel campione con la miscela infiltrazione attraverso lo scambio con una serie graduata di infiltrazione Technovit mix / EtOH combo, come segue: <ol><li> 50% Technovit / EtOH - 1 ora </li><li> Technovit 100% - 1 ora </li><li> Technovit 100% - pernottamento </li></ol></li><li> Il specimen possono essere memorizzati nel mix infiltrazione del 100% fino ad un mese a 4 ° C. Mettere un coperchio sui campioni per proteggerli dalla luce. </li></ol> Incorporare <ol><li> Fai Technovit 7100 mescolare incorporare: Prendere 0.75ml del mix di infiltrazione in un tubo di 1,5 ml e aggiungere 50 ml di indurente II. Mescolare invertendo il tubo diverse volte. </li><li> Utilizzando una pipetta di plastica trasferimento, prendete un campione infiltrati durante la notte in 0,5 ml sottile parete del condotto di PCR. Rimuovere la maggior parte del supernatante. </li><li> Aggiungere 0,25 ml della miscela incorporare fatto al punto 1 di questa sezione, &quot;Incorporamento&quot;, per il campione. Orientare l&#39;embrione diviso in due per fare il piano di dissezione di fronte alla parte inferiore del tubo, spingendo delicatamente con un sordo-punta dell&#39;ago dissezione (in legno con impugnatura ago dissezione). </li><li> Chiudere il coperchio e incubare la provetta in un luogo buio per circa quattro ore per consentire la plastica polimerizza. </li><li> Fai Technovit 3040 mix. Prendere 1 grammo di polvere di una capsula, e aggiungere 0,5 ml di liquido. Immediatamente, mix in polvere e liquido utilizzando un bluetip. Versare sopra la spacimen indurito. Questo giallo Technovit 3040 impedirà l&#39;intero blocco di plastica che esce dal tubo. </li></ol> Sezionamento <ol><li> Pulire Histoknife H con xilene (EtOH spesso non è abbastanza buono) e metterlo sul vostro microtomo. Angolo della lama a circa 45 °. Pulire l&#39;area palco davanti alla lama con xilene, anche perché la pulizia di questa zona è fondamentale per la qualità delle fette sezionato. </li><li> Tagliare il lato del tubo e la buccia di punta off con un coltello di cartone. <img src="/files/ftp_upload/old/188_2008_7_10_5/188_figure-02.jpg" alt="Figura 2" width="818" height="243" /> </li><li> Impostare il campione nel porta mandrino del microtomo. </li><li> Fissare un isolante &quot;Premere-per-seal&quot; silicio su un vetrino per fare una camera di montaggio per le fette sezione. Premere con decisione l&#39;isolatore alla diapositiva sul banco di lavoro pulito e guardare dall&#39;altra parte per assicurarsi che l&#39;isolante sia completamente inserito, senza bolle d&#39;aria. Versare pulite e calde dH 2 O (~ 40 ° C) alla piscina sul vetrino con una pipetta Pasteur, fino al livello in cui si può notare che la superficie dell&#39;acqua diventa piana, concava o convessa non in forma. </li><li> Iniziare a fare fette sezione. Per gli studi di immunofluorescenza, faccio 5 fette sezione mm. Per i campioni di ibridazione in situ, lo spessore delle fette può essere regolato nel range di ~ 3 - 8 mm, a seconda dello scopo e le intensità dei segnali. </li><li> Trasportare le fette sezione dal palco davanti alla lama alla camera di montaggio con acqua, usando un pennello di piccole dimensioni. Tenere il pennello con una fetta in cima alla piscina di acqua e rilascia la fetta fino al mare battendo con un sordo-punta dell&#39;ago dissezione. La fetta si espanderà in una forma circolare non appena colpisce la superficie dell&#39;acqua. </li><li> Quando la maggior parte del territorio delle acque superficiali della camera di montaggio è pieno di fette di sezione, succhiare quasi la metà dell&#39;acqua utilizzando una pipetta Pasteur. Incubare il vetrino in una notte più calda per fare scivolare il campione completamente asciutto. </li><li> Counter-macchia con 1 ml di DAPI (0.1mg/ml in TE) per cinque minuti. Aspirare DAPI e asciugare il campione. </li><li> Rimuovere l&#39;isolante in gomma di silicone dalla diapositiva. Ora le foto possono essere prese del campione. Conservare il campione a 4 ° C, al riparo dalla luce. </li></ol>

Anticorpo primario contro il tuo antigene o tag epitopo: Effettuare una diluizione appropriata in PBT. Biotina coniugato anticorpo secondario: vari fornitori vendono biotina-anticorpi coniugati.

incorporare plastica e sezionamento embrioni di xenopus laevis

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Sezioni di plastica mantenere morfologia vero tessuto in sezioni sottili di tessuto che può essere immunoistochimica con anticorpi secondari fluorescenti, rendendo questo metodo più utile di sezioni in paraffina o congelati per molti tipi di tessuto. Il metodo per la colorazione, di inclusione, e sezionamento è dimostrato in questo video.

Incorporare plastica e Sezionamento embrioni di Xenopus laevis

Ciao, mi chiamo Sochi Ota. Sono un ricercatore postdottorato nel laboratorio del dottor Ken Cho presso il Dipartimento di Biologia dello Sviluppo e Cellulare dell'Università della California, Irvine. Oggi vi mostrerò la preparazione di sezioni semplici di embrione di Xenopus.Questa procedura comprende la biseczione di embrioni di rana allo stadio gassoso avanzato, la colorazione con un anticorpo diretto contro la molecola di interesse, l'infiltrazione in plastica ed il taglio di sezioni di cinque micron in plastica. Questa procedura può essere utilizzata per studiare l'immunofluorescenza, l'immunohistochimica o l'ibridazione in situ con immagini ad altissima risoluzione. Ok, questi sono gli strumenti pratici e di piccole dimensioni che uso per il taglio in plastica di embrioni, per un numero pari o superiore a 10 embrioni.Questa è una pinzetta metallica con punta a delta e questa, numero uno, può essere utilizzata per orientare l'embrione nella plastica. E numero due, può essere utilizzata insieme a questo pennello per trasferire l'embrione dal microtomo alla superficie di montaggio. Questo è un isolante in gomma siliconica, che colloco sulla superficie del vetrino e che crea un menisco d'acqua in cui posso montare le sezioni di embrioni inclusi in plastica.Ora sto mostrando come bisecare l'embrione, un embrione fissato per saggi come l'ibridazione in situ o la rilevazione mediante immunofluorescenza. Per tagliare l'embrione a metà, utilizzo questa griglia da dessert estremamente sottile, che si può acquistare al negozio di alimentari. Credo che sì, gli embrioni siano stati fissati con il 3,7% di formaldeide per tutta la notte.E il modo in cui la si fissa dipende dall'obiettivo. Questa viene fissata per tutta la notte. A scopo di ibridazione con incisione, è possibile procedere con una fissazione prolungata per tutta la notte, ma per la rivelazione mediante immunofluorescenza, con cui si rileva la proteina all'interno dell'embrione, non raccomando una fissazione troppo lunga.E preferisco eseguire la fissazione con formaldeide al 3,7% per soli due ore per minimizzare l'influenza sulla localizzazione subcellulare della proteina e anche evitare una fissazione eccessiva, consentendo una buona penetrazione dell'anticorpo durante la fase di rilevamento. Ok, ora sto dissezionando questo embrione praticando un taglio nella parete blastica sul lato sinistro e sul lato destro. Ora vedo che si tratta di un embrione allo stadio 11, in cui il PO si estende completamente dal lato dorsale a quello ventrale, ma è un embrione bi a.E diamo un'occhiata a questo pezzo destro. Si osserva la blastoporo sia sul lato dorsale che su quello ventrale, ma il lato dorsale è più evidente perché questa invaginazione penetra chiaramente più in profondità all'interno dell'embrione rispetto al lato ventrale. Pertanto, si tratta di un buon campione, ben sezionato, per studiare sia il lato dorsale che quello ventrale.All'interno dell'embrione, in questo embrione dissezionato, utilizzerò la rilevazione mediante immunofluorescenza di una proteina espressa all'interno dell'embrione. Per l'immunofluorescenza o l'immunohistochimica, si utilizza un anticorpo specifico per il rilevamento. Tuttavia, il problema è che l'anticorpo non penetra molto bene all'interno dell'embrione.Quindi, se si utilizza un embrione in toto, non è possibile saperlo. Non è possibile studiare il profilo di espressione delle proprie proteine nell'embrione. Tuttavia, utilizzando questo embrione precedentemente bisecato, è possibile studiare quale sia il profilo di espressione all'interno delle cellule in profondità nell'embrione.Ah, l'embrione colorato è già stato fissato in formaldeide al 3,7%, disidratato in etanolo e infiltrato nella plastica, chiamata tecnovit 7100. Questo kit contiene tre componenti: questa parte principale liquida e questa polvere, chiamata indurente uno, e questo liquido chiamato indurente due.Per prima cosa mescolo questa parte principale con l'indurente in un rapporto di 100 a 1, ottenendo così la miscela di infiltrazione. Questa è una miscela liquida nella quale infiltrerò l'embrione. Al momento è ancora liquida, quindi non si solidificherà ancora.E questi campioni di embrione vengono lasciati in questa miscela di infiltrazione durante la notte per assicurare che i campioni di embrione siano completamente inclusi in questa plastica. Ora prelevo uno di questi campioni di embrione con una pipetta di trasferimento e lo trasferisco in una provetta sottile da 0,5 MPCL, che utilizzo come stampo per l'inclusione. Successivamente, rimuovo il liquido in eccesso da questo embrione.E ora questo embrione, questo embrione è già pronto per essere incorporato nella plastica indurente. Per preparare la plastica indurente, si mescola questa miscela di infiltrazione con il tubo indurente in un rapporto di 15 a 1. Ad esempio, se prelevo 750 microlitri di questa miscela di infiltrazione in un tubo sottostante, devo aggiungere anche 50 microlitri di questo indurente per avviare la polimerizzazione della plastica dopo l'aggiunta, ops, chiudere il coperchio e quindi mescolare delicatamente in questo modo.E non dovete fare vorticosità perché l'ossigeno è l'inibitore della reazione di polimerizzazione. Aggiungete circa 250 microlitri di questa miscela all'embrione. Questo passaggio di polimerizzazione richiede quasi quattro ore; non dovete assolutamente affrettarvi.Dopo aver aggiunto prima questa plastica polimerizzante, è possibile spostarla su e giù per far galleggiare l'embrione nella plastica. Ora uso questa pinzetta in metallo per spostare l'embrione e orientarlo in modo che la superficie di taglio dell'embrione si trovi sul fondo di questo stampo di inclusione. Quindi chiudere il coperchio, poiché l'ossigeno è un inibitore della reazione di polimerizzazione, e lasciare riposare per quattro ore per permettere il completamento della reazione di polimerizzazione.Dopo di ciò, questo è un HUD già presente nel campione. Si applica una sorta di colla su questo campione per assicurarsi che la parte rigida in plastica non esca da questo stampo. Questo è un altro tipo di plastica che funziona come colla a questo scopo, chiamato techno 30 40.E sto mescolando questa polvere e questo liquido con un rapporto di 2, 2, 1; qui ci sono 0,6 grammi di questa polvere. Quindi aggiungerò 300 microlitri di questo liquido, quindi lo mescolerò rapidamente, poiché questa plastica indurisce abbastanza velocemente. Questa è una fase in cui bisogna essere un po’ decisi, quindi verserò il composto sul campione già indurito.Questo è sufficiente. Chiudere il tappo. Io sembro così.E questo richiederà approssimativamente da 30 a 60 minuti per indurirsi. E questo è il campione pronto per essere utilizzato. Per prima cosa, taglio la punta dello stampo con un coltello per cartone, staccando questa parte terminale dallo stampo.Ora l'embrione incluso è esposto. Inoltre, rimuovo questo cappuccio poiché non ne ho bisogno. Prendo ora questa lama di tain Roy, non un ago, ma una lama di tain Roy, che è più dura della lama di acciaio normale utilizzata per la sezionatura in paraffina.Immergo brevemente questo nel Xin per pulirlo. Posizionatelo nel portalametta e rimuovete l'eccesso di zaine. A volte pulisco anche questa zona con lo zaine, poiché la pulizia di questa area è assolutamente fondamentale.Ora è pronto per essere sezionato. Prima di iniziare la sezionatura, preparo la camera di montaggio. Questa è una lamella.E sopra questo aggiungo questo silicone e spingo con decisione tutto intorno in modo che non ci siano perdite. Poi metto il tutto sul riscaldatore per vetri e aggiungo acqua pura per formare la nostra vasca. Aggiungo tanta acqua fino a raggiungere la superficie allagata.E questo è importante perché la superficie di questo strato d'acqua garantisce una distribuzione uniforme della tensione superficiale dell'acqua, elemento fondamentale affinché il taglio si espanda in modo omogeneo. Ora procedo al taglio, ma prima indosso questa mascherina perché ogni frammento di sezione è così leggero, così leggero che il mio respiro potrebbe spostarlo dal piano di lavoro. Per questo motivo indosso la mascherina.E ora inizia il sezionamento. Dopo aver ottenuto un certo numero di frammenti di sezione sul palchetto, prenderli con un pennello e spostarli lentamente sopra la camera a montagna, quindi battere leggermente il pennello in modo che i frammenti cadano nell'acqua per gravità. Non appena toccano l'acqua, si espandono formando un frammento circolare sulla superficie dell'acqua.Come appare la luce dopo l'essiccazione notturna. Ora appare così e così. Ora il campione è pronto per il contatto con il DPI per il DNA nucleare.E poi è possibile esaminare al microscopio. Oggi vi ho mostrato la preparazione di sezioni in plastica utilizzando un embrione di rana allo stadio gastrula. Questa procedura è molto utile per lo studio della subcellula o della localizzazione delle proteine, che non possono essere studiate mediante la tecnica di inclusione in paraffina, e in generale anche per l'ibridazione in situ.Questa sezione in plastica ti consente inoltre un'ibridazione residua uniforme; questo procedimento può fornirti livelli molto più elevati di segnale rispetto a quelli ottenibili con sezioni paraffinate o congelate.

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