Incorporare plastica e Sezionamento embrioni di Xenopus laevis

Sezioni di plastica mantenere morfologia vero tessuto in sezioni sottili di tessuto che può essere immunoistochimica con anticorpi secondari fluorescenti, rendendo questo metodo più utile di sezioni in paraffina o congelati per molti tipi di tessuto. Il metodo per la colorazione, di inclusione, e sezionamento è dimostrato in questo video.

Ciao, mi chiamo Sochi ota. Sono uno scienziato post-dottorato nel laboratorio del Dr.Ken Cho presso il Dipartimento di Biologia Cellulare e dello Sviluppo dell'Università della California. Irv I Oggi, vi mostrerò la preparazione della sezione simpl dell'embrione di xenopus.

Questa procedura include la bisezione dell'embrione di rana allo stadio gassoso avanzato che colora con anticorpi contro la molecola di interesse, si infiltra nella plastica e crea una sezione di plastica di cinque micron. Questa procedura può essere utilizzata per studiare l'immunoistochimica dell'immunofluorescenza o l'ibridazione in situ con immagini ad altissima risoluzione. Ok, questi sono i piccoli strumenti utili che uso per il sezionamento di plastica embrionale di 10 embrioni plus.

Questa è una pinzetta metallica con punta a delta e questa, la numero uno, può essere utilizzata per orientare l'embrione in plastica. E numero due, questo può essere utilizzato insieme a questo pennello per trasferire l'embrione dal microtomo alla superficie di montaggio. Si tratta di un isolante in gomma siliconica, che metto sulla superficie del vetrino e che fa tirare l'acqua dove posso montare le fette di embrioni sezionati in plastica.

Ora sto mostrando come dividere in due l'embrione, l'embrione fissato per il test come l'ibridazione interna o il rilevamento dell'immunofluorescenza. E per tagliare la metà dell'embrione, uso questa griglia desertica molto sottile, che puoi comprare al supermercato. Penso di sì, ci sono embrioni fissi che fissano la cellula al 3,7% di alto livello formale durante la notte.

E questo è il, il modo in cui lo risolvi dipende dallo scopo. Questo problema viene risolto durante la notte. Ai fini dell'ibridazione per incisione, si può optare per la fissazione notturna, ma per il rilevamento dell'immunofluorescenza, che si rileva la proteina all'interno dell'embrione, non ho raccomandato una fissazione troppo lunga.

E preferisco fare la fissazione dell'altezza della forma al 3,7% per sole due ore per ridurre al minimo l'influenza sulla localizzazione subcellulare della proteina ed evitare anche la fissazione eccessiva per consentire la buona penetrazione dell'anticorpo durante la fase di rilevamento. Ok, ora sto sezionando questo embrione attraverso il muro di esplosione tagliando il lato sinistro e il lato destro. Quindi ora vedo che questo ha un embrione allo stadio 11 in cui il PO è tutto il percorso dal lato dorsale al lato ventrale, ma bi un embrione.

E diamo un'occhiata a questo pezzo per la mano destra. Si vede l'esplosione sia nel lato dorsale che nel lato ventrale, ma il lato dorsale è evidente perché questa invaginazione sta chiaramente raggiungendo la profondità più profonda dell'embrione rispetto al lato ventrale. Quindi questo è un buon pezzo, un buon pezzo diviso in due per studiare sia il lato dorsale che quello ventrale.

All'interno dell'embrione, questo embrione sezionato, utilizzerò la rilevazione in immunofluorescenza della proteina espressa all'interno dell'embrione. E per l'immunofluorescenza o l'immunoistochimica, si utilizzano anticorpi specifici per il rilevamento. Ma il problema è che gli anticorpi non penetrano molto bene all'interno dell'embrione.

Quindi, se si usa l'intera montatura, l'intero embrione della montatura, non si può saperlo. Non è possibile studiare il modello di espressione delle proteine all'embrione. Ma usando questo embrione pre-sezionato, puoi studiare qual è il modello di espressione nella cellula in profondità all'interno dell'embrione.

Ah, l'embrione macchiato è già stato fissato in formaldeide al 3,7% disidratata in etanolo e infiltrata nella plastica, che si chiama techno 7, 100. E questo kit contiene tre parti, che è questa parte principale liquida e questa polvere, che si chiama indurente. E questo liquido chiamato indurente due.

Per prima cosa mescolo questa parte principale e quella dell'indurente con 100 a uno reio, che ti darà questa miscela di infiltrazione. Ed è così, è un liquido, in cui sono infiltrata in questo embrione. E questo è ancora liquido in modo che non si indurisca ancora.

E questo è quei campioni di embrioni che vengono lasciati in questa miscela di infiltrazione durante la notte per assicurarsi che il campione di embrione sia completamente riassunto in questa plastica. Ora prendo questo esemplare dell'embrione con la pipetta di trasferimento e lo trasferisco in una provetta da 0,5 MPCL a parete sottile, che uso come stampo per l'inclusione. Poi da questo embrione rimuovo il liquido in eccesso.

E ora questo embrione, questo embrione è già pronto per essere incorporato nella plastica che si sta indurendo. Per fare la plastica indurente, si mescola questa miscela di infiltrazione con questo tubo di indurimento a 15 a uno. Quindi, ad esempio, se prendo 750 microlitri di questa miscela di infiltrazione per sostenere il tubo, allora dovrei aggiungere anche 50 microlitri di questo indurente per avviare la polimerizzazione della plastica dopo averlo aggiunto, ops, chiudere il tappo e poi mescolare delicatamente in questo modo.

E non dovresti fare il vortice perché l'ossigeno è l'inibitore della reazione di polimerizzazione. Aggiungere circa 250 microlitri di questa miscela all'embrione. E questa fase di polimerizzazione richiede quasi quattro ore che dovresti, non devi affrettarti affatto.

Dopo aver aggiunto prima questa plastica polimerizzante, puoi convogliarla su e giù per far galleggiare l'embrione nella plastica. E ora prendo questa pinzetta di metallo per spingere l'embrione per orientarlo in modo che la superficie di taglio dell'embrione arrivi sul fondo di questo stampo di inclusione. Quindi chiudere il tappo perché l'ossigeno è un inibitore della reazione di polimerizzazione e lasciarlo per quattro ore per consentire la reazione di polimerizzazione.

Dopodiché, questo è un branco HUD già in campione. Metti una specie di colla su questo campione in modo da assicurarti che questa parte dura di plastica non esca da questo stampo. Questa è la, questa è un'altra plastica che funziona come colla per questo scopo chiamata techno 30 40.

E sto mescolando questa polvere e questo liquido con 2, 2, 1 ecco 0,6 grammi di questa polvere. Quindi aggiungerò 300 microlitri di questo liquido, quindi lo mescolerò rapidamente e questa plastica diventa dura abbastanza rapidamente. Quindi questa è una parte, devi essere un po' duro e poi riversare questo su questo campione già ascoltato.

Questo è abbastanza buono. Chiudere il tappo. Io ho questo aspetto.

E questo impiegherà dai 30 ai 60 minuti per diventare difficile. E questo è quello che è pronto per l'azione. Per prima cosa, taglio la punta dello stampo con un coltello di cartone, tolgo questa parte della punta da questo stampo.

Ora l'embrione incorporato viene esposto. E ho anche tagliato questo tappo perché non ne ho bisogno. Ora prendo questo ago per la macchia di Roy, intendo non per la lama di Roy, che è più dura della normale lama per la macchia usata per il sezionamento del parin.

Lo immergo brevemente nello Xin per renderlo pulito. Impostarlo su il, impostarlo sul portalama e rimuovere la schiuma in eccesso. E a volte pulisco anche questa zona con la zaine perché la pulizia di questa zona è assolutamente importante.

Ora è pronto per il sezionamento. Prima di iniziare il sezionamento, ho installato la camera di montaggio. Quindi questo è un vetro scorrevole.

E oltre a questo, sto inserendo questa gomma siliconica e spingendo l'agricoltore a spingere fino in fondo in modo che non ci sia, non ci saranno perdite. E metti questo sullo scaldascivolo e versa questa acqua di medice pulita per fare la nostra piscina. E metti tanta acqua per farti arrivare fino a quando non ottieni la superficie dell'acqua superficiale dell'alluvione.

E questo è importante perché questa superficie dell'acqua di inondazione fornisce una distribuzione uniforme della tensione superficiale dell'acqua, che è importante per far sì che la sezione si estenda in modo uniforme. Ora sto facendo il sezionamento, ma prima di farlo indosso questa maschera perché ogni pezzo di sezione è così leggero, così leggero e mio, il mio seno può volare via dal palco. Quindi indosso questa maschera.

E ora inizia il sezionamento. Dopo aver ottenuto un certo numero di pezzi di sezione sul palco, lo prendi con il pennello e ti muovi lentamente in cima a questa camera di montagna e colpisci questo pennello per far entrare quei pezzi in acqua per gravità. E non appena atterrano sull'acqua, si estendono fino a formare un pezzo circolare sulla superficie dell'acqua.

Com'è quella luce dopo l'asciugatura notturna. Ora è così e così. Ora il campione è pronto per entrare in contatto con DPI per il DNA nucleare.

E poi puoi studiare al microscopio. Oggi vi ho mostrato la preparazione della sezione di plastica utilizzando l'embrione di rana in fase di gas tardivo. Questa procedura è molto utile per studiare la sottocellula o la localizzazione di proteine, che non possono essere studiate utilizzando la tecnica dell'inclusione di paren e anche in generale per l'ibridazione residua.

Questa sezione di plastica ti dà anche per l'ibridazione residua, questa procedura può darti un livello molto più alto di quelle immagini rispetto al campione di sezione congelata o parente.