Preparazione di oligomeriche β-amiloide 1-42 E induzione di Impairment plasticità sinaptica in fettine di ippocampo
14 luglio 2010
Una caratteristica della malattia di Alzheimer è l'elevazione di Aβ 1-42 Peptide. Qui forniamo un protocollo per la preparazione di Aβ sintetico 1-42 Oligomeri, che danneggia dell'ippocampo potenziamento a lungo termine, un cellulare correlato di memoria. Questa procedura è utile per lo studio dei meccanismi di Aβ indotta lo screening della patologia e della droga.
Il beta amiloide sintetico 1-42 viene risospeso in HFIP per primeggiare il peptide e successivamente concentrato fino a formare un film per la ligamentizzazione. Il film viene risospeso in DMSO, diluito in tampone fosfato e incubato durante la notte. Infine, il peptide oligomerico viene diluito con tampone di registrazione e perfuso su fette ippocampali acute, dove viene valutata l'esposizione efficace del beta amiloide sulla plasticità sinaptica.
Benvenuti al laboratorio di Avio Orio presso la Columbia University di New York City. Ciao, oggi vi mostreremo una procedura che abbiamo ottimizzato per la preparazione di tutti i tipi di beta amiloide Li Rise, basata su un protocollo inizialmente proposto da Stein e colleghi nel 2003. In questo laboratorio, abbiamo utilizzato questa procedura per studiare la disfunzione sinaptica indotta dal beta amiloide.
Cominciamo. Lasciare che il flaconcino di polvere liofilizzata di beta amiloide raggiunga la temperatura ambiente per 30 minuti, per evitare la condensazione quando verrà aperto sotto cappa. Aprire il flaconcino e aggiungere HFIP ghiacciato per ottenere una concentrazione finale di beta amiloide pari a 1 mM.
Chiudere il vial e vortexare; utilizzando una siringa Hamilton, dividere rapidamente la soluzione in parti uguali tra tre microprovette in polipropilene a basso legame. Chiudere le provette e incubare per due ore a temperatura ambiente per permettere al peptide di miscelarsi. Aprire le provette e posizionarle in un evaporatore sotto vuoto (speed vac) per concentrare la soluzione. Centrifugare a 800 G sotto vuoto per circa 15 minuti.
Assicurarsi che la temperatura non superi i 25 gradi Celsius per evitare il degrado proteico. La centrifugazione è completata quando si osserva un film chiaro e secco di peptide sul fondo del tubo. Il film potrebbe essere difficile da vedere; sigillare i tubi e conservare le aliquote non utilizzate a meno 80 gradi Celsius per un massimo di sei mesi nella cappa. Aggiungere DMSO per risospendere il film di peptide a una concentrazione finale di cinque millimolare e sottoporre a sonica in un bagno d'acqua per 10 minuti.
Per garantire una sospensione completa del peptide, conservare aliquote di 1,6 microlitri della soluzione di beta amiloide a cinque millimolari a meno 20 gradi Celsius. Ogni aliquota deve essere scongelata una sola volta, il giorno prima dell'esperimento: scongelare un'aliquota della soluzione di beta amiloide a cinque millimolari e aggiungere 98,4 microlitri di tampone fosfato sterile per ottenere un volume finale di 100 microlitri, vorticare per 30 secondi e incubare a quattro gradi Celsius per 12 ore. Per permettere l'inizio della ligamentizzazione, avviare l'esperimento incubando un lisato ippocampale fresco per 90 minuti.
Nel buffer standard per la registrazione, l'elettrodo stimolante viene posizionato sui collaterali di Shafer e l'elettrodo di registrazione viene posizionato sullo strato radiato. Una volta individuata una risposta e stabilita una linea di base costante per 10 minuti, diluire il ligando beta-amiloide a 200 nanomolari. Il beta-amiloide si lega in modo non specifico al vetro nel buffer di registrazione, quindi è preferibile utilizzare materiale in plastica il più possibile.
Perfondere la soluzione di beta amiloide sui preparati per 20 minuti. Applicare la stimolazione tetanica desiderata. Ad esempio, una raffica theta immediatamente dopo il tetano, quindi ripristinare la perfusione con soluzione di registrazione normale.
Monitorare la registrazione per almeno due ore dopo il tetano per confermare l'induzione della potenziamento a lungo termine (LTP) e osservare gli effetti del trattamento con beta amiloide. È stato appena mostrato come preparare il beta amiloide oligomerico da 1 a 42 per indurre un'alterazione della plasticità sinaptica su fette di ippocampo. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che l'eccessiva essiccazione del film peptidico può portare a una ligandizzazione incompleta.
È inoltre fondamentale utilizzare materiale in plastica per le soluzioni di amiloide beta per prevenire il legame peptidico non specifico. Grazie per averci seguito e buona fortuna con i vostri esperimenti.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per la preparazione di oligomeri sintetici di Aβ 1-42, noti per compromettere la Potenziamento a Lungo Termine dell'ippocampo, un meccanismo chiave legato alla memoria. La procedura è essenziale per lo studio della patologia indotta da Aβ e per scopi di screening farmacologico.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Biologia Cellulare
- Ricerca sulla Malattia di Alzheimer
Sfondo
- La malattia di Alzheimer è caratterizzata da livelli elevati del peptide Aβ 1-42.
- Gli oligomeri di Aβ 1-42 sono implicati nella disfunzione sinaptica.
- La potenziamento a lungo termine (LTP) è un correlato cellulare della memoria.
- Comprendere gli effetti di Aβ può contribuire allo sviluppo di farmaci.
Scopo dello studio
- Fornire un protocollo dettagliato per la sintesi di oligomeri di Aβ 1-42.
- Studiare i meccanismi del danno sinaptico indotto da Aβ.
- Facilitare lo screening di farmaci potenzialmente utili per il trattamento dell'Alzheimer.
Metodi Utilizzati
- Risospensione della beta amiloide sintetica in HFIP.
- Concentrazione del peptide in un film per la fibrillizzazione.
- Risospensione in DMSO e incubazione in tampone fosfato.
- Valutazione dell'esposizione alla beta amiloide su fette ippocampali acute.
Risultati Principali
- Gli oligomeri di Aβ 1-42 preparati compromettono efficacemente la plasticità sinaptica.
- Il protocollo consente risultati riproducibili nello studio del malfunzionamento sinaptico.
- I risultati contribuiscono alla comprensione del ruolo di Aβ nella patologia di Alzheimer.
- Applicazioni potenziali nella selezione di farmaci per trattamenti contro l'Alzheimer.
Conclusioni
- Il protocollo per la sintesi di oligomeri di Aβ 1-42 è efficace e affidabile.
- Questo studio migliora la comprensione dell'impatto di Aβ sui processi legati alla memoria.
- Le ricerche future possono basarsi su questi risultati per esplorare opzioni terapeutiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
L'alterazione della plasticità sinaptica ippocampale indotta dall'oligomero di β-amiloide1-42 fornisce un modello solido e rilevante per la patologia, utile per la ricerca sulle fasi iniziali dell'Alzheimer. Questo paradigma consente una riduzione del rischio meccanicistica e una maggiore affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi terapeutici e nel test di composti per la disfunzione sinaptica. L'approccio supporta la selezione del portafoglio chiarificando la rilevanza traslazionale di interventi candidati mirati alla patologia indotta dall'amiloide.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi della disfunzione sinaptica indotta da amiloide in un sistema controllato ex vivo.
- Supporta la validazione funzionale di bersagli quantificando il deterioramento della LTP dopo l'esposizione a oligomeri di β-amiloide.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico delle ipotesi sulla malattia di Alzheimer a livello sinaptico.
- Fornisce una piattaforma per una valutazione predittiva affidabile nella fase iniziale di analisi dei composti.
Sviluppo di screening e saggi
- Stabilisce un saggio riproducibile per quantificare il deterioramento della plasticità sinaptica in fette di ippocampo.
- Standardizza la preparazione e l'applicazione di β-amiloide oligomerico per ottenere risultati di saggio costanti.
- Consente una valutazione affidabile di composti candidati per la loro capacità di attenuare la perturbazione del potenziamento a lungo termine (LTP).
- Permette la scalabilità e il riutilizzo della piattaforma per iniziative di screening ad alto rendimento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- È allineato ai meccanismi rilevanti per la malattia coinvolti nella patologia iniziale di Alzheimer.
- Fornisce continuità dall'interazione con il bersaglio molecolare fino agli esiti sinaptici funzionali.
- Informerà le decisioni di avanzamento con rischio calibrato, collegando gli effetti del composto a biomarcatori traslazionali della salute sinaptica.
- Supporta la selezione e la validazione di modelli preclinici per studi in vivo successivi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo collega la fase iniziale della scoperta alla validazione preclinica, permettendo la verifica delle ipotesi, la riduzione del rischio associato al target e una valutazione quantitativa della funzione sinaptica in risposta all'esposizione all'amiloide.
- Biologia della scoperta: Facilita il test dell'ipotesi nulla relativa al danno sinaptico indotto da amiloide e la chiarificazione dei percorsi coinvolti.
- Screening: Fornisce un saggio standardizzato e riproducibile per la valutazione di composti in grado di contrastare la perturbazione del potenziamento a lungo termine (LTP).
- Analisi: Fornisce letture quantitative della plasticità sinaptica per confronti statistici robusti tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati ottenuti ex vivo a biomarcatori rilevanti per la malattia e a endpoint preclinici.
- Riutilizzo aziendale: Offre un flusso di lavoro riutilizzabile per campagne continue di validazione di bersagli e screening nei portafogli dedicati alle malattie neurodegenerative.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi nell'Alzheimer.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità dei saggi di alterazione sinaptica.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento o interruzione e l'efficienza del capitale concentrandosi su esiti funzionali rilevanti per la malattia.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione e la progressione di asset nel campo della neurodegenerazione con adeguamento del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione di peptidi, nella preparazione di fettine di ippocampo e nella registrazione elettrofisiologica.
- Necessita dell'accesso a strumentazione specializzata per la misurazione della potenziamento a lungo termine (LTP) e a sistemi di perfusione controllati.
- Richiede una rigorosa standardizzazione intersoggettiva della preparazione dei peptidi e dei protocolli sperimentali.
- Potrebbe richiedere adattamenti per diversi sistemi modello o classi di composti in base alle proprietà di solubilità e legame.
- I limiti pratici includono la variabilità dell'aggregazione dei peptidi e la sensibilità alle condizioni sperimentali.
