Singola unità In vivo Registrazioni dal chiasma ottico di Rat

Oggi presenteremo un sistema di registrazione che abbiamo sviluppato per registrare in vivo dal chiasma ottico del ratto. Questi tipi di registrazioni sono stati molto rari nel ratto, in parte perché gli assoni delle cellule gangliari retiniche che compongono il nervo ottico sono molto piccoli, rendendo difficile la registrazione da singole cellule, e poiché il ratto è un modello animale comune per la degenerazione retinica, questi tipi di registrazioni hanno il potenziale per produrre molte informazioni utili. La chiave per ottenere queste registrazioni è stata negli elettrodi di vetro colorato di tung che abbiamo progettato, che hanno una punta lunga e affilata che consente di registrare i potenziali d'azione da assoni di diametro sottile con un elevato rapporto segnale/rumore.

Vi guideremo attraverso il processo di fabbricazione di questi elettrodi e vi mostreremo come, come impostiamo l'animale sull'apparato stereotassico, e poi vi mostreremo un esempio di registrazione di treni di spike da una singola cellula ganglionaria. Per fabbricare gli elettrodi sono necessarie tre attrezzature principali, un soffiatore di vetro standard per realizzare le micro pipette. Una macchina da cucire viene utilizzata per affilare il tungsteno e un microscopio standard con obiettivo 40x.

Inoltre, è necessario un anello di grafite con il palo attaccato e verrà posto nella soluzione concentrata di idrossido di potassio e nitrato di sodio. Questo viene posizionato sotto il braccio di cucitura, quindi un sottile pezzo di filo di tungsteno viene quindi fissato con nastro adesivo al braccio di cucitura, parzialmente immerso nella soluzione. I cavi vengono quindi applicati all'asta di grafite su un'estremità nel braccio di cucitura.

Sull'altro due volt verranno applicati attraverso i cavi e la macchina da cucire si accende. Questo immerge il dunston in soluzione e lo affila elettromagneticamente per due minuti. Una volta che il tungsteno è affilato, viene accuratamente rimosso dal braccio di cucitura, quindi immerso in acqua per rimuovere la soluzione in eccesso e quindi posizionato al microscopio sotto l'obiettivo 40 x.

La micropipetta in vetro ha un'apertura di piccolo diametro di circa uno o due micron di diametro. Il tungsteno affilato viene quindi inserito con cura nell'estremità posteriore della micropipetta e spinto con un micromanipolatore meccanico. Il tungsteno viene spinto attraverso l'estremità del vetro con molta attenzione.

È importante che ci sia una perfetta aderenza tra il tungsteno e il vetro, ed è comune spingere abbastanza in modo che una piccola quantità di vetro si rompa effettivamente. Una piccola quantità di colla pazza può essere applicata all'estremità posteriore della micro pipetta per fissare il tung al vetro. Ora che la fabbricazione dell'elettrodo è completa, la sua impedenza viene misurata utilizzando un elettrodo metallico Test di impedenza.

Generalmente cerchiamo impedenze vicine a un mega ohm. L'elettrodo viene quindi riposto in una custodia per la custodia, poiché è molto fragile. Gli stimoli visivi sono presentati su un monitor posizionato su una piattaforma mobile.

La coperta riscaldante viene utilizzata per controllare la temperatura corporea dell'animale e il sistema stereotassico consente il movimento grossolano del microazionamento, che viene mostrato qui. La custodia metallica nella protezione dell'ago guida ipodermico, l'elettrodo di registrazione agisce per ridurre i livelli di rumore. L'ago guida viene inserito nel cervello e un microazionamento viene utilizzato per abbassare lentamente l'elettrodo attraverso l'ago guida.

Questo è illustrato qui dove la custodia metallica è abbassata su una traversa che poggerà sul cranio dell'animale. L'ago di guida sporgerà sotto la traversa come mostrato e il contatto elettrico tra la custodia metallica e la traversa agisce per ridurre i livelli di rumore. L'animale viene quindi posizionato sulla coperta riscaldante.

Le barre auricolari sono inserite con cura. A questo punto è importante assicurarsi che la testina rimanga in piano. Viene quindi inserita una barra dentata per assicurarsi che la testa sia in tutte le direzioni.

Una sonda rettale viene inserita utilizzando vaselina. Questo misurerà la temperatura corporea, che viene poi utilizzata per controllare la temperatura della coperta riscaldante. La temperatura corporea dovrebbe rimanere tra i 36 e i 37 gradi.

Un singolo elettrocatetere ECG viene inserito nella pelle per monitorare la frequenza cardiaca, che generalmente è di circa 300 piedi al minuto. La frequenza cardiaca è un buon indicatore della profondità dell'anestesia. I parametri vitali dell'animale sono continuamente monitorati con software personalizzati.

Questi includono la pressione sanguigna titolata CO2, la temperatura corporea e la frequenza cardiaca. La pelle viene quindi rimossa dalla parte superiore del cranio e il cranio viene esposto. È importante pulire accuratamente il cranio per vedere i marcatori cranici corretti che vengono utilizzati per trovare il chiasma ottico.

Il gruppo della traversa viene quindi posizionato in posizione. Questo viene utilizzato per tracciare un cerchio di cinque millimetri sul cranio che verrà poi perforato e rimosso. Il foro verrà praticato attorno al marcatore del teschio bgma illustrato qui.

Il cranio esposto è mostrato con un segno circolare a matita attorno al bgma, che verrà perforato prima che il cranio venga perforato. Il sistema stereotassico deve essere calibrato torema, e questo viene fatto allineando l'ago guida con precisione sul bgma e documentando la posizione dello stereo. Dopo la perforazione, il cranio è stato rimosso e il cervello è esposto.

Dopo che il cranio è stato perforato, l'animale viene paralizzato e ventilato per impedire i movimenti oculari. Questo viene fatto con un'iniezione endovenosa di gamina. La respirazione viene attentamente monitorata così com'è e, quando la respirazione si interrompe, il tubo di ventilazione viene inserito nel connettore tracheale, a quel punto l'animale respira artificialmente.

L'ago guida viene quindi calato nel cervello. L'elettrodo di registrazione verrà abbassato attraverso il gyal a circa 8-10 millimetri sotto il cranio, dove possono essere registrati i potenziali d'azione delle cellule visive nel chiasma ottico. L'elettrodo viene lentamente caricato nel cervello.

Con il micro drive, si può sentire una cellula visiva che si muove spontaneamente, ascolta la cellula, risponde alla presenza di una bacchetta portatile nel suo campo ricettivo. Viene quindi presentato il grading drifting e, a questo punto, qualsiasi stimolo visivo di interesse può essere utilizzato per studiare le proprietà di risposta delle cellule gangliari retiniche utilizzando il chiasma ottico. Registrazione.