Due-Photon-Based fotoattivazione in Live embrioni di zebrafish

L'obiettivo generale del seguente esperimento è attivare fotochimicamente un agente sensibile alla luce, come un colorante fluorescente chimicamente incapsulato, in un singolo embrione di pesce zebra vivo con risoluzione a livello cellulare. Questo viene ottenuto iniettando un agente sensibile alla luce in embrioni allo stadio monocellulare che esprimono un marcatore genetico vitale, al fine di localizzare e indirizzare con precisione qualsiasi cellula di interesse. Come secondo passaggio, gli embrioni vengono coltivati e montati in agarosio a basso punto di fusione, che immobilizza l'embrione vivo.

Successivamente, si utilizza la microscopia a due fotoni per localizzare un marcatore transgenico fluorescente visibile. L'agente fotosensibile viene quindi attivato in un piano focale desiderato e l'estensione dell'attivazione fotochimica viene monitorata. Il destino delle cellule etichettate risultanti può quindi essere tracciato in stadi embrionali successivi.

Questa procedura può essere utilizzata per l'attivazione di una varietà di composti a risoluzione di singola cellula in campioni vivi. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la microscopia confocale o la lampada flash, è che consente l'attivazione fotoindotta di tessuti relativamente profondi a un livello assiale di pochi micron con una fototossicità relativamente bassa. Tuttavia, il metodo qui presentato è utilizzato per il tracciamento del margine della colonna vertebrale ed è applicabile all'attivazione fotoindotta di una varietà di componenti, consentendo un controllo mirato sui processi di sviluppo e su quelli fisiologici. La sera prima dell'iniezione, preparare vasche di accoppiamento separando maschi e femmine di pesce zebra di una linea transgenica che esprime un marcatore fluorescente visibile.

In questo esperimento, la linea transgenica esprime GFP sotto il controllo del promotore neurogenico N one. Scongelare un'aliquote di fluoresceina incapsulata con dextrano al 5% in cloruro di potassio 0,2 molare su ghiaccio, quindi diluire la fluoresceina incapsulata in cloruro di potassio 0,2 molare fino a una concentrazione finale dell'1%. Mantenere la fluoresceina su ghiaccio e proteggerla dalla luce. Far accoppiare gli incroci di pesce zebra, raccogliere le uova fecondate non appena deposte e risciacquarle come descritto nel testo. Utilizzare una pipetta di plastica per trasferire gli embrioni allo stadio di una singola cellula in una piastra di iniezione con agarosio all'1%, sovrapposta con mezzo E tre fresco, sotto un microscopio stereoscopico.

Utilizzare la pipetta per orientare gli embrioni nelle scanalature di iniezione. Spezzare la punta di un ago capillare per iniezioni, precedentemente tirato in una punta lunga e affusolata. Utilizzare una punta di microcaricamento per riempire posteriormente l'ago con circa un microlitro di fluoresceina caging al 1%.

Posizionare l'ago caricato su un micromanipolatore collegato a un microinjector pneumatico. Iniettare in ciascun embrione da due a tre nanolitri di fluoresceina caging direttamente nel citoplasma della cellula. Iniettare almeno 50 embrioni per esperimento.

Trasferire gli embrioni iniettati in una capsula di Petri contenente mezzo E3 fresco e incubare al buio a 28,5 gradi Celsius fino allo stadio di sviluppo desiderato. Inibire la pigmentazione aggiungendo feniltiourea allo 0,1% agli embrioni a 24 ore per prepararli al montaggio. Rivestire 15-20 capsule di Petri da 60 millimetri con uno strato sottile di agarosio all'1% disciolto in mezzo E2 fresco; una volta che l'agarosio si è solidificato, riempire la capsula con mezzo E2 sotto un microscopio stereoscopico.

Utilizzare pinzette affilate per trasferire gli embrioni iniettati su piastre rivestite. Evitare di esporre gli embrioni all'aria. Mantenere un'aliquote di agarosio al 2% a basso punto di fusione in acqua.

In un blocco riscaldante a 72 gradi Celsius. Utilizzare una pipetta con estremità arrotondata a fiamma per trasferire un embrione rivestito in circa 150 microlitri di mezzo in una piastra di Petri da 60 millimetri. Posizionare un volume simile di Agros al 2% accanto all'embrione e mescolare rapidamente le due gocce per ottenere una goccia omogenea di Agros all'1%.

Orientare l'embrione con il lato dorsale rivolto verso l'obiettivo della lente. Lasciare solidificare gli aros, quindi immergere l'embrione incorporato nel mezzo E due. Posizionare l'embrione appena montato su un supporto per piastra sotto un microscopio a due fotoni dotato di un laser a tavolo girevole a banda larga.

Prima di iniziare il processo di attivazione fotoindotta, acquisire una serie di immagini dal margine più ventrale a quello più dorsale del tessuto che esprime, a 860 nanometri e spazio. Le immagini distano sei micron l'una dall'altra sul piano Z. Selezionare il piano Z bersaglio per l'attivazione fotoindotta e metterlo a fuoco utilizzando GFP come riferimento.

Individuare la regione di interesse. Acquisire una singola immagine a 860 nanometri e mantenerla aperta in una finestra separata per un corretto allineamento. È fondamentale che il laser a 720 nanometri sia in uno stato di blocco di modo prima di aprire il menu di editing della fotobleach.

Utilizzare l'immagine acquisita a 860 nanometri per definire la regione di interesse o ROI per l'attivazione fotochimica. Nella finestra di modifica della fotobleach, regolare la potenza relativa del laser, il numero di iterazioni e la velocità di scansione. Per l'attivazione fotochimica, premere "bleach" quando il laser si è arrestato, tornare a 860 nanometri e acquisire un'immagine a singolo piano per valutare l'intensità del materiale attivato fotochimicamente risultante.

Acquisire uno stack di immagini per valutare lo zsan o lo spessore del dominio attivato. In questo modo, è possibile determinare empiricamente l'intensità del laser e la durata dell'esposizione. Per un'attivazione foto ottimale di ciascun clone o di un incrocio foto, attivare tutti gli embrioni rimanenti per l'esperimento.

Utilizzando queste condizioni, coltivare gli embrioni fotoattivati montati al buio a 28,5 gradi Celsius in mezzo E2 contenente 0,1% di feniltiourea fino al raggiungimento dello stadio di sviluppo desiderato. Sotto un microscopio stereoscopico, utilizzare un bisturi appuntito per praticare un'incisione a forma di V nell'aro vicino all'embrione montato, con la punta dell'incisione rivolta verso la testa dell'embrione. Posizionare un paio di pinze chiuse nel punto dell'incisione.

Aprire delicatamente la pinzetta separando gli aros lungo la lunghezza dell'embrione e rilasciando l'embrione nel mezzo. Dopo aver rilasciato ciascun embrione, utilizzare una pipetta di Pasteur flame-polished per raccoglierlo in una provetta microcentrifuga. In una cappa chimica, fissare gli embrioni con formaldeide al 4% per tre ore.

A temperatura ambiente, procedere con la disidratazione, la riedratazione e la colorazione con fosfatasi alcalina, coniugata, anti-fluoresceina, e tutti i relativi lavaggi come descritto nel testo allegato. Aggiungere 500 microlitri di soluzione filtrata di fast red agli embrioni. Incubare al buio a temperatura ambiente, rinnovando ogni ora con una nuova soluzione di colorazione fast red fino al raggiungimento del rapporto segnale/sfondo desiderato.

Interrompere la reazione di colorazione con tre lavaggi in PBST di cinque minuti ciascuno. Nella cappa, fissare il colorante in formaldeide al 4% per 20 minuti. Lavare due volte in PBST per cinque minuti ciascuno.

Lavare gli embrioni trasparenti attraverso una serie di gradienti di glicerolo al 25%, 50% e 75% in PBS finché ciascun embrione si deposita sul fondo del tubo. Conservare gli embrioni a quattro gradi Celsius fino al momento della visualizzazione al microscopio. Per montare gli embrioni per la visualizzazione, utilizzare una siringa da un millilitro per applicare quattro gocce da 20 microlitri di grasso siliconico trasparente agli angoli di una forma quadrata di 15 millimetri su un vetrino da microscopio.

Posizionare un embrione in circa 200 microlitri di glicerolo al 75% tra le gocce di grasso. Posizionare un coprioggetto sull'embrione. Premere delicatamente il coprioggetto verso il basso fino a quando la soluzione di glicerolo non si espande completamente.

Lo spazio tra le gocce di olio in cui sono montati gli embrioni può essere conservato per alcuni giorni a quattro gradi Celsius prima della visualizzazione mediante microscopia confocale. Questa immagine mostra un embrione di pesce zebra vivo che esprime GFP sotto il controllo di neurogen. In un promotore che è stato iniettato con un tracciante fluorescente caged di fluoresceina allo stadio a una singola cellula utilizzando il metodo descritto, allo stadio da tre a cinque somiti.

Un'area distinta dei quattro emisferi cerebrali primordiali è stata attivata fotochimicamente mediante un laser a due fotoni e il tracciante fluorescente di fluoresceina liberato è stato rilevato. Successivamente alla procedura di attivazione fotochimica, l'embrione è stato incubato a 28,5 gradi Celsius e le cellule cerebrali contenenti la fluoresceina liberata sono state rintracciate mediante immunomarcatura anti-fluoresceina in rosso a 24 ore dalla fecondazione. Si noti il ridotto numero di cellule marcate. Una volta padroneggiata, la procedura di attivazione fotochimica può essere eseguita in poche ore. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di controllare i parametri ottimali, consentendo un'attivazione fotochimica precisa con risoluzione a singola cellula.