Misura del Complemento 50% emolitica (CH ₅₀) Attività di siero

Misurare l'attività complemento CH50 emolitica al 50% nel siero. È necessario disporre di una pipetta in grado di erogare 200 microlitri e di un’altra che può erogare 1000 microlitri, siero da test, che è stato conservato sul ghiaccio, globuli rossi di pecora sensibilizzati, soluzione salina tamponata varone, acqua distillata, provette per il test, siero e provette per il controllo di base e per la lisi totale, un agitatore vortex e una piastra a 96 pozzetti con fondo piatto. Etichettare le provette singolarmente come controllo e con la diluizione finale. In questo caso, si inizia con una diluizione uno ad otto.

Proseguire con diluizioni doppie, ottenendo diluizioni di uno a 16, uno a 32, uno a 64 e uno a 128, etichettando i tubi rimanenti come "blank" e "total lysis". Una volta etichettati tutti i tubi, è possibile iniziare a diluire il siero in esame. Iniziare trasferendo 300 microlitri di tampone salino R in un tubo nuovo.

Ora trasferire 100 microlitri di siero nel tampone R di 300 microlitri. Questo permetterà di ottenere una diluizione iniziale uno a quattro. Assicurarsi che il campione di siero sia mescolato accuratamente.

Ora trasferire 200 microlitri di soluzione salina tamponata in tubi che sono stati etichettati in precedenza. Inoltre, aggiungere 200 microlitri di soluzione salina tamponata nei due tubi vuoti fino al numero totale di tubi di lisi. Aggiungere 200 microlitri di acqua distillata, non soluzione salina tamponata Verona.

Ora trasferire 200 microlitri del siero diluito uno a quattro nel tubo etichettato uno a otto. In precedenza abbiamo trasferito 200 microlitri di soluzione salina al buffet nel serie di tubi da uno a otto fino a uno a centoventotto. Questo produrrà ora una diluizione uno a otto.

Mescolare bene il campione, quindi trasferire 200 microlitri nel tubo etichettato uno su 16. Procedere fino a quando l'intera serie di tubi è stata diluita. Scartare 200 microlitri dalla diluizione uno su 1 28 in modo che il volume finale sia di 200 microlitri.

Le cellule del sangue di pecora sensibilizzate potrebbero essersi sedimentate nel tempo. Queste dovranno essere risospese ribaltando delicatamente il tubo un certo numero di volte. Una volta risospese completamente, trasferire 200 microlitri delle cellule del sangue di pecora sensibilizzate in ciascuno dei tubi preparati.

Assicurarsi che il siero sia mescolato accuratamente con i globuli rossi. I globuli rossi di pecora sensibilizzati aggiunti al tubo bianco permetteranno di determinare la lisi spontanea, mentre il sangue aggiunto al tubo per la lisi totale permetterà di determinare il valore del 100%. Utilizzando un agitatore vortice impostato su velocità bassa, mescolare delicatamente ciascun tubo. Successivamente, posizionare i tubi in un bagnomaria a 37 gradi Celsius e incubare per 30 minuti.

Dopo 15 minuti, agitare delicatamente i tubi per l'incubazione e quindi incubare ulteriormente per 15 minuti. Al termine dell'incubazione, trasferire i tubi in una centrifuga impostata a quattro gradi Celsius e centrifugare a 1500 G per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, rimuovere con attenzione i tubi e posizionarli in un apposito supporto. In questa fase si osserverà il pellet di globuli rossi, mentre l'SNA appare rosso.

A causa del rilascio dell'emoglobina, aggiungere 100 microlitri di acqua distillata nel numero richiesto di pozzetti di una piastra a fondo piatto con nove o sei pozzetti. Con attenzione per evitare il trasferimento del pellet, trasferire 100 microlitri del soprannatante S in un pozzetto appropriato della piastra a nove o sei pozzetti. Una volta che tutti i campioni sono stati caricati sulla piastra, leggere l'assorbanza utilizzando un fotocolorimetro per piastre impostato a 540 nanometri.

Qui abbiamo i dati grezzi di assorbimento per le due repliche. A uno e B uno. Fare riferimento alla diluizione uno a otto.

Poi abbiamo i dati per 1 su 16, 1 su 32, 1 su 64 e 1 su 128. A6 e B6 sono i bianchi. Mentre A7 e B7 rappresentano la lisi totale.

Dopo aver raccolto i dati, è necessario calcolare l'assorbanza media per ciascun campione in duplicato. Successivamente, sottrarre l'assorbanza del bianco, che corrisponde alla lisi spontanea, da tutti i campioni. Una volta raccolti tutti i dati, è ora possibile calcolare la percentuale di lisi per ciascuna diluizione utilizzando la seguente formula.

Dopo aver calcolato tutti i dati, riportare la percentuale di lisi sull'asse verticale rispetto al diluizione del siero sull'asse orizzontale. Il grafico risultante può quindi essere utilizzato per calcolare la diluizione del siero necessaria per lisare il 50% dei globuli rossi sensibilizzati. Questo grafico mostra la percentuale di lisi riportata in funzione del fattore di diluizione del siero.

È quindi possibile tracciare una linea dal 50% di lisi fino all'intersezione con la curva. Nel punto in cui la curva viene intersecata, si traccia una linea verticale verso l'asse orizzontale. Questo valore rappresenta il fattore di diluizione a cui il siero deve essere diluito per garantire una lisi del 50%. Confrontando due campioni di siero per determinare se esiste una differenza nel CH 50, la diluizione che fornisce una lisi del 50% può essere utilizzata come misura.