Indagare tessuti e risposte fitocromo organo-specifici utilizzando FACS-Cell-assistita di tipo profili specifici di espressione in Arabidopsis thaliana

Per esaminare le risposte delle fitocromi in specifici tipi cellulari vegetali. GAL 4G FP enhancer trap e linee transgeniche U-A-S-B-V-R vengono incrociate per produrre piante carenti di fitocromo. I protoplasti fogliari della progenie ottenuta dall'incrocio tra U-A-S-B-V-R e GA 4G FP vengono isolati dalle piante.

Successivamente, i protoplasti vengono separati in base ai fatti per isolare protoplasti GFP negativi e protoplasti GFP positivi in campioni separati; i protoplasti isolati vengono analizzati mediante microscopia confocale a scansione laser. Per confermare il recupero di protoplasti GFP positivi, l'RNA viene estratto dai protoplasti e analizzato in modo spettrale. Ciao, sono Sanka Pivar del laboratorio di BARDA Montgomery presso il Dipartimento di Ricerca sulle Piante del Laboratorio di Energia del Michigan State University.

Oggi vi mostreremo un procedimento per isolare protoplasti fogliari da una pianta ANA per l'analisi dell'espressione genica specifica per tipo cellulare mediante sorting cellulare assistito da fluorescenza. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare risposte dipendenti dai fitocromi specifiche per tessuti e organi.

La linea ANA di Arabidopsis utilizzata in questa procedura è stata generata mediante un approccio bipartito basato su enhancer trap. Uno dei genitori proviene da una libreria di linee con trappola di enhancer che mostrano diversi pattern di espressione di gal o di altri geni. Il genitore uno esprime inoltre GFP sotto il controllo di una sequenza di attivazione upstream o UAS.

In breve, il fattore di trascrizione GA quattro attiva qualsiasi gene posizionato sotto il controllo dell'UAS. Nella linea parentale uno, GA quattro attiva GFP; il genitore uno è stato incrociato con il genitore due, nel quale il gene BVR è sotto il controllo di GAL quattro attraverso UAS.

La linea risultante dall'incrocio è U-A-S-B-V-R incrociata con G 4G FP. Nelle linee parentali, la biosintesi del cromoforo della fitocromocromo quattro procede da un LA attraverso l'eme fino al biver, abbreviato bv. Tuttavia, nella progenie, il prodotto del gene BVR blocca la biogenesi del cromoforo della fitocroma riducendo il precursore BV. Questa linea di progenie con trappola di potenziamento BVR è stata confermata e può essere utilizzata per esaminare come una riduzione dei livelli attivi di fitocroma influisca su diversi tessuti vegetali.

Iniziare questa procedura preparando il terreno e i vasi per la coltivazione delle piante, al fine di generare protoplasti fogliari. Si seminano circa 2000 semi sterilizzati per campione per esperimento nel terreno contenuto nei vasi. Si aggiunge acqua nella parte inferiore del vassoio contenente i vasi e l'intero vassoio viene ricoperto con pellicola di plastica.

Coltivare le piante per cinque settimane sotto illuminazione bianca a 22 gradi Celsius e umidità al 70%. Dopo i primi cinque-sei giorni, confermare la germinazione dei semi e rimuovere la pellicola di plastica dal vassoio. Per isolare i protoplasti, preparare innanzitutto il buffer TEX: per un litro di buffer, pesare i sali GA's B, MES, cloruro di calcio, nitrato di ammonio e saccarosio.

Sciogliere completamente i componenti in circa 900 millilitri di acqua deionizzata distillata, abbreviata DD H2O, e portare il pH a 5,7 con KOH 1 M. Portare quindi il volume finale a un litro e sterilizzare per filtrazione.

Successivamente, raccogliere foglie verdi e sane dalle piante. Raccogliere circa 250 millilitri di foglie leggermente compresse in un becher. Sciacquare le foglie con 40 millilitri.

DD H2O quattro volte seguito da un risciacquo due volte con DD H2O sterile utilizzando un bisturi numero 20. Tagliare le foglie in strisce sottili e dividere equamente il tessuto in due tubi di plastica sterili da 50. Un volume x di soluzione digestiva per le foglie viene preparato aggiungendo un’aliquota di cinque millilitri di soluzione madre 10 x, preparata sciogliendo il 2% peso/volume di mazie R 10 e il 4% peso/volume di cellulasi on azua R 10 in buffer TEX, a 45 millilitri di buffer TEX fresco.

Aggiungere circa 25 millilitri di una x digestione fogliare. Mescolare con le strisce di foglie in ogni provetta in modo che tutto il tessuto fogliare sia ricoperto. Procedere con il vuoto, infiltrando il tessuto fogliare nella digestione.

Mescolare in provette aperte per un'ora a temperatura ambiente utilizzando un essiccatore sotto vuoto collegato a una pompa per acqua. Mantenere le provette contenenti il tessuto fogliare e la miscela di digestione delle foglie avvolte in foglio di alluminio per evitare l'esposizione alla luce. Proseguire con un'incubazione di tre ore a temperatura ambiente su un agitatore con movimento lento.

Dopo tre ore, aumentare per due minuti la velocità dell'agitatore per rilasciare i protoplasti. Filtrare la sospensione grezza di protoplasti attraverso due strati di garza sterile per rimuovere i detriti e raccogliere il filtrato in un becher di vetro sterile. Filtrare il filtrato attraverso una maglia di nylon sterile da 100 micrometri in una piastra di Petri sterile.

Raccogliere il flusso passante e trasferirlo in un nuovo tubo sterile da 50 millilitri. Utilizzare circa da 15 a millilitri di tampone TEX fresco per lavare la piastra di Petri sterile e raccogliere eventuali protoplasti presenti sulla superficie. Centrifugare il flusso passante a 100 × g a 10 gradi Celsius per 15 minuti, utilizzando una centrifuga con rotor a cestello oscillante, con accelerazione impostata a sei e decelerazione a zero al termine della centrifugazione.

Utilizzare una pipetta sterile di nove pollici in vetro collegata a una pompa peristaltica per rimuovere circa 25-30 millilitri del liquido al di sotto dello strato di protoplasti galleggianti, che contiene detriti residui e pellettizzati, senza disturbare lo strato di protoplasti galleggianti, lasciandone circa 10-50 millilitri. Dopo aver rimosso i detriti pellettizzati, aggiungere buffer TEX fresco fino a un volume finale di 40 millilitri. Mentre si risospendono delicatamente i protoplasti, ripetere la rimozione dei detriti e la risospensione dei protoplasti galleggianti rimanenti.

Altre due volte per rimuovere la maggior quantità possibile di detriti cellulari D. Il tempo di centrifugazione viene ridotto a 10 minuti nella prima ripetizione e a cinque minuti nell'ultima ripetizione. Infine, utilizzare una pipetta sterile da un millilitro per aspirare i protoplasti in sospensione e trasferirli in un nuovo tubo da 15 millilitri.

Procedere direttamente al sorting prima del sorting. Esaminare i protoplasti mediante microscopia confocale a scansione laser o CLSM, in breve, utilizzando un laser a 488 nanometri per l'eccitazione al fine di confermare l'integrità dei protoplasti e la presenza della fluorescenza GFP nel pool di protoplasti. È necessario un minimo di detriti cellulari per evitare l'occlusione del beccuccio di sorting; effettuare il sorting dei PROTOPLASTI isolati nel buffer TEX mediante fax.

Utilizzando un ugello da 200 micrometri su una testa di sorting macro con frequenze di evento comprese tra 6.000 e 15.000 e una pressione del sistema di circa nove PSI seguendo un protocollo adattato, utilizzare PROTOPLASTI selvatici non GFP per determinare le soglie di autofluorescenza al fine di raccogliere protoplasti positivi per GFP eseguendo il sorting delle cellule mediante un laser Argonne a gas attivato a 100 milliwatt sulla linea argon da 488 nanometri. Per identificare la fluorescenza GFP, utilizzare un filtro passa-banda 530/30 dopo il recupero dei protoplasti positivi per GFP. Esaminare nuovamente i protoplasti ordinati al microscopio come in precedenza all'inizio del sorting per il profilo di espressione.

Estrai l'RNA totale dai protoplasti ordinati. Successivamente, il cDNA può essere preparato per l'ibridazione. Il cDNA viene quindi sottoposto a ibridazione con array genomici interi TH one OPSYS Ametri.

Di seguito sono riportati alcuni risultati rappresentativi del sorting dei protoplasti nel controllo di tipo selvatico. I protoplasti non mostrano alcun segnale nel gate positivo per GFP. Tuttavia, segnali positivi per GFP vengono identificati nei campioni di protoplasti isolati dalle linee GAL 4G FP prima del sorting; i protoplasti isolati da piante di tipo selvatico non mostrano alcuna fluorescenza GFP nelle analisi mediante CLSM.

Mentre una miscela di protoplasti privi e dotati di fluorescenza GFP viene rilevata nei campioni di protoplasti provenienti da linee GAL 4G FP dopo i fatti. L'analisi mediante CLSM indica l'isolamento di protoplasti positivi per GFP da una linea rappresentativa GAL 4G FP; l'RNA è estraibile dai protoplasti isolati e un millilitro fornisce una quantità sufficiente di RNA per essere rilevato mediante fluorospettrometria. Abbiamo appena mostrato come isolare protoplasti fogliari da atopia ANA per la selezione cellulare assistita da fluorescenza e l'analisi dell'espressione genica specifica per tipo cellulare.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di manipolare delicatamente i protoplasti e limitarne l'esposizione alla luce. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.