PMS2 carente, ERCC1, Ku86, CcOI in Difetti del campo durante la progressione a tumore del colon

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare le alterazioni specifiche nei proteine di riparazione del DNA, nell'espressione o nell'espressione delle proteine associate all'apoptosi che sono frequenti nelle aree circostanti i tumori del colon e quindi probabilmente centrali nella progressione verso il cancro del colon. Questo viene ottenuto raccogliendo innanzitutto campioni di tessuto in barattoli contenenti formalina, provenienti dalla mucosa colica, dalla mucosa colica normale durante colonscopie come tessuti di controllo o dalla mucosa colica adiacente ai tumori del colon ottenuti da resezioni coliche come tessuti sperimentali, dopo fissazione formale e immersione per quattro ore. Questi tessuti vengono trasferiti in alcol al 70% per tutta la notte, seguito dall'inclusione in blocchi di paraffina.

Il secondo passaggio della procedura consiste nel tagliare sezioni di tessuto dai blocchi e trasferirle su vetrini microscopici. Il terzo passaggio della procedura consiste nell'immunostainare le sezioni di tessuto per possibili proteine di interesse utilizzando un supporto sequenza. L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'osservare le sezioni di tessuto al microscopio fotomicroscopico.

In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano elevati livelli di espressione di una o più proteine nella mucosa colica priva di neoplasia locale e una ridotta espressione di queste proteine nei difetti di campo circostanti i tumori del colon, indicando l'importanza della loro riduzione nella progressione verso il cancro del colon. Ad esempio, questa immagine mostra una colorazione bruna che indica elevati livelli di espressione di E rcc, uno nella mucosa colica senza neoplasia colica. Questa immagine successiva mostra una colorazione bruna che indica un elevato livello di espressione di PMs, due nella mucosa colica di un paziente senza neoplasia colica, mentre un'area di mucosa colica vicina a un cancro del colon mostra una cripta con elevata espressione di PMs, due, e alcune con bassa espressione, e un'altra area vicina a un cancro del colon con assenza di espressione di PS due.

Ciao, sono Hoy Wynn del laboratorio di Carol Bernstein del Dipartimento di Biologia Cellulare e Anatomia della Facoltà di Medicina dell'Università dell'Arizona. Sono Kristi Luo. Sono Alex Fta.

Sono Nadia Suna e siamo tutti del laboratorio Bernstein. Oggi vi mostreremo sezioni di tessuto prelevate durante una colonscopia e una procedura per tagliare sezioni da questi campioni di tessuto. Successivamente illustreremo le procedure per l'immunomarcatura di queste sezioni di tessuto.

Mostreremo anche come esaminiamo i nostri preparati istologici al microscopio. I preparati vengono analizzati per l'espressione di proteine che potrebbero essere rilevanti per la progressione verso il cancro del colon. Utilizziamo questi procedimenti per scoprire carenze nelle proteine di riparazione del 2D NA.

ERC uno e PMMS due sembrano essere tra i primi passaggi nell'insorgenza di un difetto di campo che può portare a un cancro del colon. Utilizziamo anche queste procedure per eliminare altre proteine probabilmente importanti nelle fasi iniziali della progressione verso il cancro del colon, come la proteina per la riparazione del DNA CO 86 e la proteina legata all'apoptosi CCO uno. Cominciamo dunque. Biopsie di tessuti mucosi colici normali vengono prelevate dai pazienti durante una colonscopia di screening e collocate in barattoli contenenti formalina.

Dopo quattro ore, il formolo viene sostituito con alcol al 70%. Vengono prelevati campioni simili di tessuto da aree di resezione del colon a un centimetro e dieci centimetri di distanza da carcinomi del colon e da adenomi con neoplasia avanzata. I campioni di tessuto vengono inviati a un laboratorio di istologia per essere processati in blocchi di paraffina prima della sezionatura.

I blocchi di paraffina vengono raffreddati in frigorifero per facilitarne il taglio; si eseguono sezioni tissutali di quattro micron di spessore mediante microtomo e si fanno galleggiare sull'acqua al fine di confrontare l'espressione di due proteine. Ad esempio, ERC uno e PMS due prelevano sezioni tissutali alternate su due vetrini, fino a ottenere tre sezioni tissutali su ciascuno dei due vetrini. Per esempio, le sezioni uno, tre e cinque possono essere posizionate su un vetrino etichettato ERC uno, mentre le sezioni due, quattro e sei possono essere posizionate su un vetrino etichettato PMS due.

La procedura per la colorazione immunoistochimica. Le sezioni di tessuto precedentemente preparate devono essere trattate sotto cappa chimica con pressione d'aria negativa, in modo che l'operatore non venga esposto ai vapori. Il protocollo che utilizziamo è abbastanza standard, tuttavia, per ottenere risultati simili ai nostri.

Quando si utilizza questo protocollo nel proprio laboratorio, potrebbero essere necessari aggiustamenti per tenere conto di variabili come la qualità dell'acqua, la potenza del microonde e la concentrazione degli anticorpi. In questo video, illustreremo le PM di immunohistochemica eseguendo prima la deparaffinizzazione dei vetrini immergendoli in tre bagni di xilolo per tre minuti ciascuno, seguiti da tre bagni di due minuti ciascuno in etanolo al 100%, quindi da due bagni di due minuti ciascuno in etanolo al 95%. Infine, lavare i vetrini in due bagni di acqua distillata.

Successivamente, posizionare i vetrini in una soluzione tampone e portarla a ebollizione in un forno a microonde. Seguire con 10 minuti a potenza media. Questo passaggio, chiamato recupero dell'epitopo indotto dal calore, rompe i legami incrociati formati nel campione di tessuto durante la fissazione con formalina e consente all'anticorpo di riconoscere la proteina di interesse dopo il raffreddamento su ghiaccio per 20 minuti.

I vetrini vengono lavati in PBS e acqua distillata per tre minuti ciascuno. Successivamente, i vetrini vengono posti in una soluzione di perossido di idrogeno al 3% per 20 minuti. Lo scopo di questo passaggio è bloccare l'attività perossidasica endogena nel tessuto.

Inoltre, bloccando questa attività, riduciamo la colorazione di fondo non specifica che potrebbe essere causata dall'anticorpo dopo 20 minuti nel blocco della perossidasi endogena; successivamente, i vetrini vengono lavati in acqua distillata e quindi in PBS per tre minuti ciascuno. Per la colorazione immunoistochimica, posizionare i vetrini su portavetrini piatti e stretti chiamati sequina e risciacquare con PBS. I vetrini destinati alla colorazione per PS due o ERCC uno vengono quindi sottoposti a un trattamento aggiuntivo di 10 minuti con tre gocce di una soluzione proprietaria chiamata sniper, che agisce riducendo la colorazione non specifica delle proteine di fondo.

Dopo aver lavato con tampone TBST, le preparazioni vengono incubate con l'anticorpo anti-PS due dopo due ore; quindi lavare le preparazioni tre volte con tampone e aggiungere 100 microlitri di anticorpo secondario biotinilato. Aggiungere una diluizione 1:100 e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente; dopo 30 minuti, lavare nuovamente le preparazioni tre volte con tampone TBST. Aggiungere tre gocce del reagente di colorazione vectoriale A B, C su ciascuna preparazione e incubare a temperatura ambiente per altri 30 minuti dopo l'incubazione.

Lavare una volta con TBST e trasferire i vetrini dalla sequina in un portavetrini contenente PBS. Successivamente, immergere i vetrini nel substrato dab per un massimo di cinque minuti, controllando attentamente che la colorazione bruna non diventi troppo scura. Segue una controcolorazione con una soluzione diluita di ematina per 10 secondi, quindi risciacquare accuratamente i vetrini prima con acqua corrente e poi con acqua deionizzata, disidratare i vetrini due volte per due minuti ciascuno in etanolo al 95%, due volte per due minuti ciascuno in etanolo al 100% e due volte per due minuti ciascuno in xilene.

Infine, aggiungere alcune gocce di mezzo di montaggio su ogni vetrino e applicare un coprioggetto. Ora, Hein DW esaminerà una sezione di tessuto colorata al microscopio foto modic per rilevare l'espressione di ERCC uno nei Crips della mucosa colica. Osserveremo innanzitutto una sezione di tessuto colonico al microscopio foto moic con un obiettivo da 20 x.

La freccia gialla indica una cripta del colon. Questa cripta contiene circa 200 cellule della cripta del colon. Queste sono le cellule stromali S.

Questo è un cripto luminale e questo è il lume del colon attraverso cui passano le feci. Esistono tre tipi diversi di cellule del cripto del colon. Le cellule caliciformi hanno una forma simile a un bicchiere da vino e i loro nuclei si trovano sul margine esterno del cripto, mostrato qui e evidenziato in rosso.

Hanno anche una sezione dilatata, piena di granuli bianchi di mucina, nella parte della cellula situata all'interno della cripta, mostrata qui. Gli altri due tipi di cellule appaiono in parte simili nelle nostre sezioni colorate. Si tratta di enterociti e cellule enteroendocrine, i cui nuclei si trovano anch'essi al margine esterno della cripta, alla base delle cellule, indicati qui dai cerchi rossi.

Questa sezione particolare è stata colorata per ER CC uno. La colorazione marrone mostra la localizzazione di ER C uno. Quasi tutti i nuclei in tutti i Crips in questa sezione mostrano un'espressione normalmente elevata di ER CC uno.

La colorazione blu è l'ematossilina, che colora il DNA nei nuclei come mostrato qui. I nuclei nella cripta presentano una colorazione più marrone che blu a causa dell'elevata espressione di ERCC1. Ora esamineremo il tessuto utilizzando l'obiettivo da 10x.

Si noti come la maggior parte delle cripte del colon mostri livelli elevati di espressione di EER CCC one. Qui abbiamo un'area con alcune cripte che mostrano un'espressione più bassa di ER CCC one, indicata dai nuclei colorati di blu. Avvicinandoci alla fine del tessuto, osserviamo un'altra area con espressione ridotta di ER CC one.

Ora torneremo indietro e osserveremo più attentamente le cripte carenti di ERCC1. Utilizzando l'obiettivo da 20x, possiamo vedere una cripta con bassa espressione di ERCC1 accanto a una cripta con elevata espressione di ERCC1. Osservate come la proteina ERCC1 sia espressa in maggiore quantità nel citoplasma della cripta deficitaria, indicando che ERCC1 viene prodotta ma non è in grado di entrare nei nuclei.

Ora, con l'obiettivo da 40x, possiamo vedere più chiaramente che l'ERCC1 non è stato in grado di entrare nei nuclei di questa cripta deficitaria, rispetto ai nuclei altamente espressivi dell'altra cripta, con scarsa presenza di ERCC1 nel citoplasma. Questo tessuto è stato prelevato mediante biopsia da un paziente con anamnesi di cancro al colon. Successivamente, Nadia Una esaminerà una sezione di tessuto colorata per l'espressione di CCO1 in cripte della mucosa colica. Possiamo analizzare una sezione di tessuto mediante immunomarcatura per la citocromo C ossidasi 1 o CCO1 utilizzando un obiettivo da 40x per CCO.

Uno è una proteina citoplasmatica e non è espressa nei nuclei, motivo per cui i nuclei sono colorati solo di blu; CCO uno è espresso nel citoplasma, come mostrato dalla colorazione bruna. In questo campo visivo, è possibile osservare due cripte del colon, una con espressione positiva di CCO uno e l'altra con carenza nell'espressione di CCO uno, spostandosi lungo questa sezione di tessuto. Si noterà che la maggior parte delle cripte del colon presenta un'espressione positiva di CCO uno.

Ora Hoy Quinn mostrerà a CCO una colorazione immunoistochimica Crips che indica la regione delle cellule staminali della cripta e la sua funzione. Stiamo osservando una sezione di tessuto colorata per CCO. I rapporti indicano che ci sono meno di cinque cellule staminali alla base della cripta, che danno origine alle 2000 cellule totali della cripta.

La regione delle cellule staminali è mostrata nella casella rossa indicata qui. Una cellula staminale con una mutazione o un'epimutazione può colonizzare l'intera nicchia delle cellule staminali o metà della nicchia staminale. Qui abbiamo Crips che mostrano un'espressione normalmente elevata di ccl, uno dei quali indica cellule staminali prive di mutazione per uno.

Qui abbiamo un esempio di come una mutazione abbia determinato una colorazione alterata in un intero cripto. Per CCL uno, notare l'assenza di espressione di CCL uno in tutto il cripto, specialmente se confrontata con un cripto normalmente colorato. Qui abbiamo un esempio di come una mutazione abbia determinato una colorazione alterata in metà di un cripto.

Si noti come questa sezione della cripta mostri bassi livelli di espressione di CCO uno rispetto a questa sezione della cripta, che mostra un elevato livello di espressione di CCO uno. Ora, Nadia Suna mostrerà le colorazioni immunoistochimiche per CCO uno in sezione trasversale, indicando che alcune cripte presentano sezioni trasversali originate da cellule staminali mutate prive di cco. Uno Ecco una sezione di tessuto colorata immunoistochimicamente per CO uno che mostra cripte del colon tagliate in senso trasversale.

Analizzeremo questa sezione utilizzando un obiettivo da 20x. Sono presenti due coppie di cripte di pesca che mostrano un'espressione positiva di CO uno e una struttura di pesca con carenza di CCO O uno in una cripta. Questa cripta mostra una carenza nell'espressione di CCO O uno in tutta la struttura, dove tutte le cellule staminali della cripta sono diventate cellule deficienti di CCO O uno.

Queste due cripte mostrano conversioni parziali in cui circa il 50% delle cellule staminali era carente nell'espressione di CCO uno. Queste cellule staminali hanno dato origine alla metà carente. Ora, Alex FTA esaminerà un'immunomarcatura su sezione di tessuto per CCO uno e identificherà elementi del tessuto ai fini dell'individuazione di alcune altre strutture nel tessuto.

Osserveremo una sezione colorata per la CCO; quella con un obiettivo 10x, indicata dal riquadro rosso, mostra un nodulo linfatico, il bordo luminale, le cellule interstiziali dette anche cellule della stroma S e la muscolaris, che si estende lungo il tessuto. Ora esamineremo un vetrino che mostra un tessuto prelevato da un'area apparentemente normale di una resezione, effettuata quando a un paziente è stato asportato un segmento del colon. Quest'area, molto vicina a un cancro del colon, può essere considerata affetta da un difetto di campo da cui è originato il tumore.

Alcuni Crips presentano livelli più elevati e altri livelli più bassi di espressione. Per ERCC1, Christi Luau ci mostrerà come viene valutato questo tessuto. Qui c'è un'immagine a mosaico acquisita con un obiettivo 10x di una sezione di tessuto strettamente adiacente a un tumore, colorata per ERCC1 vicino a un cancro.

Molte altre crips presentano spesso una carenza di ER CCC uno. Valuteremo il livello di espressione di ER C uno utilizzando un obiettivo da 40x e assegneremo alle crips un punteggio da zero a quattro in base al livello di espressione di ER CC uno. Ogni sezione di tessuto nell'immagine a bassa risoluzione viene quindi punteggiata con un colore blu per un'elevata espressione (livello quattro), verde per un'espressione abbastanza elevata (livello tre), giallo per un'espressione ridotta (livello due), arancione per un'espressione molto bassa (livello uno) e nero per assenza di espressione (livello zero).

Livello zero. Ecco il primo grido che valuteremo. Come si può vedere, i nuclei lungo questo margine sono quasi completamente carenti.

Sull'altro estremo. C'è una piccola quantità di espressione e definiamo questo livello criptico uno per una colorazione molto bassa e un punto arancione tratteggiato. Questa cripta presenta una quantità abbastanza elevata di colorazione in quasi tutti i suoi nuclei, ottenendo un punto verde per il livello tre.

Per confronto, tutti i nuclei a livello della luce presentano una colorazione di grado quattro molto intensa. Questa cripta mostra una bassa espressione di ERC uno lungo questo margine, quindi la coloriamo di giallo per il livello due.

Questo cripto mostra un'espressione elevata su un bordo e un'espressione piuttosto elevata su questo bordo, e pertanto assegniamo un punto verde per un'espressione complessiva di livello tre. Questo cripto presenta un'espressione ridotta di ERC uno ed è contrassegnato con un punto giallo al livello due. Questo cripto ha un'espressione elevata di livello quattro e gli assegniamo un punto blu.

Nel complesso, questo sembra avere un livello di espressione ridotto di due, ottenendo un punto giallo. Consideriamo i livelli di espressione crips da zero a due, rispettivamente rosso, arancione e giallo, come espressione ridotta o assente, mentre i livelli tre e quattro, verde e blu, sono considerati espressione relativamente alta. Questa sezione di tessuto presentava 44 crips con espressione bassa e 23 crips con espressione relativamente alta.

Pertanto, il 67% dei Crips in questa sezione di tessuto vicino a un tumore presentava un'espressione ridotta o assente di ERCC in una sezione di tessuto. Sezioni di tessuto tagliate una dopo l'altra da un blocco di tessuto, con tagli alternati posizionati su vetrini separati, ci permettono di osservare gli stessi Crips colici su due vetrini diversi. Queste sezioni di tessuto sono state ottenute da tessuto prelevato molto vicino a un carcinoma del colon.

Abbiamo colorato un vetrino con un anticorpo contro ERC uno e l'altro vetrino con un antibiotico contro PMs due. Queste sezioni di tessuto sono mostrate da Christi Luau. Qui abbiamo una delle due sezioni di tessuto consecutive tagliate in prossimità di un'ammina di cancro al colon, colorata per EER CCC uno con un obiettivo 10x.

È possibile osservare che ER CCC uno è fortemente colorato in prossimità della luce, anche se la maggior parte delle cripte non è colorata. Si può inoltre notare la stessa colorazione rotonda nelle cellule interstiziali a un ingrandimento maggiore. Vediamo che questa cripta presenta un'elevata espressione di ERCC uno.

Qui abbiamo una seconda sezione tissutale consecutiva vicino al tumore del colon, immuno marcata per PS due. Procedendo nell'analisi di questa sezione tissutale, la cripta che ha mostrato marcatura per ER CCC uno, presenta anche marcatura per PMs due. A un ingrandimento maggiore, osserviamo un'elevata espressione di pmms due nella stessa cripta.

Qui, entrambi i cripti sono accoppiati. Si può osservare un'elevata espressione di ERC uno in questo caso. Analogamente, lo stesso cripto colorato per PMs due presenta anch'esso un'espressione elevata.

Questi Crips adiacenti non mostrano un'espressione elevata, come mostrato qui e qui; anche i Crips adiacenti considerati per i PM2 non mostrano un'espressione elevata qui e qui. Utilizziamo inoltre l'immunohistochimica per determinare la frequenza di Crips carenti di KU 86 e CCO1. In questa diapositiva, verrà esaminata un'intera sezione di tessuto ottenuta vicino a un carcinoma del colon e sottoposta a colorazione immunoistochimica per KU 86.

Si osserva che alcune Crips risultano carenti di KU 86 in questa sezione di tessuto associato al cancro. Utilizziamo inoltre l'immunohistochimica per determinare la frequenza di Crips deficienti per K Kuku 86 e CCL una neoplasia del colon. In questa diapositiva, esaminiamo una parte di una sezione di tessuto sottoposta a colorazione immunoistochimica per KU 86, utilizzando un obiettivo 10x.

Mentre esploriamo il tessuto, osserviamo che la maggior parte delle cripte mostra un elevato livello di espressione di KU 86. Tuttavia, come indicato dai riquadri rossi, vi sono alcune cripte carenti di KU 86. In questa diapositiva, Alex FTA analizzerà un'intera sezione di tessuto ottenuta da un colon neuroendocrino canceroso, sottoponendola a colorazione immunoistochimica per CCO1.

Stiamo ora osservando una sezione di tessuto prelevata a un centimetro di distanza da un carcinoma del colon, sottoposta a immunoistochimica per CCO1 con un obiettivo 10x. Possiamo notare una cripta con elevata espressione di CCO1, così come un gruppo di cripte con bassi livelli di espressione di cco. O1 qui è una cripta efficiente.

Questa porzione presenta un elevato livello di espressione, mentre questa porzione ha un basso livello di espressione. Scorrendo attraverso questa sezione del tessuto, possiamo notare che la maggior parte dei Crips ha un elevato livello di espressione. Ho precedentemente contato tutti questi Crips.

C'è un totale di 189 cripte e 45 di queste sono carenti di CCO1, il che corrisponde a una frequenza di circa il 23,8% di cripte carenti di questa proteina. Circa la metà delle cripte esprime in modo elevato NCCO1, mentre l'altra metà è carente di CCCO1. Si osserva che le cripte carenti di CCO1 non sono tanto frequenti vicino ai tumori del colon quanto le cripte carenti di PMS2 o ERCC1. Le cripte carenti di CCO1 tendono ad avere una frequenza del 10-20% di carenza, mentre le cripte carenti di ERCC1 e PMS2 tendono a presentare una carenza del 70-90% nelle vicinanze del cancro del colon. Vi abbiamo appena mostrato come sezionare mediante immunoistochimica sezioni di tessuto della mucosa colica per proteine che potrebbero essere importanti nella progressione verso il cancro del colon.

Abbiamo inoltre mostrato come valutare questi tessuti per carenze di determinate proteine presenti nei Crips. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante avere tre sezioni di tessuto per ogni vetrino. Possono formarsi bolle durante l'applicazione del mezzo, trasportando l'anticorpo, impedendo ai Crips o a porzioni di essi di legarsi adeguatamente semplicemente perché una bolla impedisce all'anticorpo di reagire con la sezione di tessuto.

I cripti hanno generalmente un diametro di 60 micron e le sezioni di tessuto sono spesse quattro micron, quindi potrebbero esserci fino a 15 sezioni di tessuto che attraversano lo stesso cripto. Di solito è possibile identificare lo stesso cripto utilizzando la morfologia del cripto come guida su più sezioni di tessuto posizionate su un vetrino. Ecco tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.