Name: Preparazione di Sviluppo e degli adulti Drosophila Brains e retina per limaging dal vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-15T17:55:00.000+00:00
Duration: 16 min 47 s
Description: Impara a preparare cervelli e retina di Drosophila per imaging in vivo e immunistochimica. Questo protocollo dimostra tecniche di dissezione per studiare i fotorecettori con microscopia confocale a scansione risonante.

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Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti della Fondazione Welch (I-1657) e il NIH (RO1EY18884). PRH è uno studioso Eugene McDermott nella ricerca biomedica.

1. Introduzione In questo video, ci mostrerà come preparare il cervello della Drosophila e retina per l&#39;imaging dal vivo e immunoistochimica con particolare attenzione alla cellule visive. In primo luogo, mostreremo come prepararsi per dissezioni del cervello. Successivamente, ci dimostrerà due dissezioni di base comunemente utilizzata per immunoistochimica che costituiscono la base per la preparazione dal vivo. Queste due preparazioni sono il cervello adulto e dissezioni occhio. Successivamente, viene mostrata la dissezione utilizzati per l&#39;imaging dal vivo del cervello adulto e di sviluppo con enfasi sul loro utilizzo per l&#39;imaging dal vivo dei fotorecettori. Infine, verranno descritti come tessuto vivo di immagini e mostrano alcuni esempi di immagini dal vivo mediante risonanza microscopia confocale. 2. Dissezione preparazione <ol><li> Per dissezioni bene, avete bisogno di pinze taglienti. Utilizzando un blocco di affilatura o della carta abrasiva finissima (&gt; 1500), passare delicatamente la pinza avanti e indietro su entrambi i lati fino a quando il sbarcare il lunario in un punto bene. Usiamo un sasso standard di nitidezza. Noi non coprirà la tecnica affilatura qui, ma nota che pinze taglienti sono essenziali per dissezioni dal vivo. Affiliamo pinze prima di ogni dissezione. </li><li> Per dissezioni cervello adulto, posto le mosche su un CO 2 pad per anestetizzare loro e risolvere il genotipo desiderato. Per dissezioni pupa, è sufficiente raggiungere nel flaconcino e con attenzione rimuovere una pupa con la pinzetta, facendo attenzione ad evitare di rompere il bozzolo. </li><li> Inumidire un Kimwipe con l&#39;acqua. Si utilizzerà questo durante la dissezione per rimuovere i detriti dal forcipe. Posizionare un piatto dissezione sul palco di uno stereoscopio e riempirlo con HL3 soluzione 1. Tutte le dissezioni sarà condotto in HL3 per garantire che il tessuto rimane viva e sana durante la procedura di dissezione. Inoltre, utilizziamo un piatto dissezione che ha una copertura inferiore del Sylgard per proteggere forcipe durante la dissezione. </li><li> Ora, preparare fissaggio soluzione se si prevede di eseguire immunoistochimica. 180μL luogo di HL3 in una provetta 500μL. Aggiungere 20μL di formaldeide al 37% per ottenere una soluzione di formaldeide 3,7%. </li><li> Infine, la posizione della mano corretta è importante per dissezioni bene. Con la posizione di buona mano, il forcipe sarà stabile e capace di movimenti controllati e sottile. In primo luogo, posto la pinza sul lato del pollice. Quindi portare l&#39;indice verso il basso in modo che la punta del dito poggia sulla parte superiore. Ora resto il lato della pinza sul lato del dito medio e passare il piatto dissezione. Entrare in contatto fisico con il piatto con il pollice e il dito medio. Mentre a riposo il pollice e il dito medio sul piatto, pianta il polso sul palco microscopio. In questo modo, si hanno tre punti ben piantati sulle superfici durante la dissezione ed è ora possibile rendere molto sottili manipolazioni della pinza. Questa tecnica può sentire un po &#39;scomodo all&#39;inizio, ma con la pratica, vi sarà presto un maestro di dissezioni del cervello. </li></ol> 3. Cervello adulto <ol><li> Sulla rampa di CO 2, orientare un adulto volare lato ventrale con la testa fuori dalla tua mano. Afferra il torace appena sotto la testa. Se fatto correttamente, le gambe e la proboscide si estenderà. Durante la visualizzazione sotto uno stereoscopio, afferrare la proboscide estesa con il forcipe per rimuovere la testa. Gettare il corpo e immergere la testa. Rifocalizzare sulla testa sommersa. La dissezione intero sarà eseguita in soluzione. E &#39;molto importante per tenere su la testa con una pinza in ogni momento. In caso contrario, la testa galleggia ed è difficile da recuperare. Se la testa si sposta fuori fuoco durante la dissezione, dovrai semplicemente spostarlo di nuovo nel piano focale senza regolare il microscopio. Questo compito apparentemente semplice può essere difficile all&#39;inizio, ma mantenendo la testa a fuoco diventa più facile nel tempo. </li><li> Iniziare la dissezione dal primo strappo del tessuto connettivo tra la proboscide e l&#39;occhio. Lacrima attraverso l&#39;occhio tenendo saldamente con almeno un forcipe in ogni momento. Siate certi che la punta della pinza è appena sotto la retina o cuticola, per evitare di danneggiare il cervello sotto. Alternando sinistra e destra, utilizzare il forcipe per strappare la retina, lavorando verso la parte posteriore della testa. Strappare la retina aumenta le possibilità che la lamina rimane attaccato al lobo ottica in tutto questo dissezione. Proseguite per tutta la parte posteriore della testa, strappando cuticola lungo la strada. Lacerano l&#39;altro occhio e iniziare a tirare via cuticola. Finché siete afferrare cuticola, sai che non si schiaccia il cervello! Con questo in mente, continuano a tirare cuticola e la retina via fino a quando il cervello è rivelato. </li><li> Una volta che il cervello è visibile, è possibile iniziare a rimuovere trachea collegato al cervello (Fig. 1A). Continuare a tirare in trachea e cuticola fino a quando il cervello è isolato. A questo punto, si dovrebbe riorientare alla parte inferiore del vostro piatto per tha rimanenti gradini. Rimuovere la trachea rimanenti perché il vostro cervello può galleggiare in caso contrario durante i lavaggi di anticorpi durante la notte. Per l&#39;imaging dei terminali dei fotorecettori, è auspicabile mantenere la lamina, ma è necessario rimuovere la retina, che contiene i corpi cellulari e pigmento fortemente autofluorescenti. Per fare questo, estrarre con cautela i resti folta e pigmentate cellulare senza danneggiare la lamina. Questa è una abilità più fine e richiede pratica. </li><li> Il cervello adulto può essere mantenuto in vita per ore o anche giorni, utilizzando le condizioni di cui parleremo nel paragrafo 6. Per l&#39;immunoistochimica, il cervello adulto è pronto per essere fissato in formaldeide. 2 Utilizzare un pipetteman P20 impostato su 5μL per spostare il cervello adulto alla soluzione di fissaggio che avete già preparato. Continuare a sezionare il cervello adulto per 20 minuti, che dovrebbe cedere 40-10 cervello. Lasciare il cervello in correzione per ulteriori 40 minuti, tuttavia tale periodo può variare per colorazione ottimale anticorpo primario. Rimuovere la soluzione di formaldeide e lavare il cervello 3 volte per 5 minuti ciascuno in 400μL di una soluzione contenente PBS e 0,4% TritonX-100, di seguito denominato PBS-Triton. Dopo il lavaggio completamente la soluzione correzione, è possibile aggiungere la soluzione primaria di anticorpi. </li></ol> 4. Occhio adulto <ol><li> Iniziare questa dissezione come descritto per il cervello adulto. Dopo sommergendo la testa e mettere al centro del microscopio, inizia a strappare il tessuto connettivo tra la proboscide e l&#39;occhio. Sopra la proboscide, separare la cuticola dall&#39;occhio. Ora, a parte la cuticola dalla parte inferiore dell&#39;occhio, lavorando verso la parte posteriore della testa. Con una pinza, afferrare il centro della parte posteriore della testa. Con l&#39;altro, afferrare l&#39;occhio e tirare. Lasciare l&#39;occhio di depositarsi sul fondo del piatto (Fig. 1B). La lamina probabilmente essere ancora attaccato ad occhio e può essere utilizzato per l&#39;imaging dal vivo dei terminali di fotorecettori completamente intatte in questo momento. Per continuare con immagini dal vivo di corpi cellulari dei fotorecettori, andare alla sezione 4.5. Le prossime tre sezioni spiegare immunoistochimica occhio fisso. </li><li> Per l&#39;immunoistochimica, spostare lo sguardo a fissare soluzione con un pipetteman P20 impostato su 5μL. Continua dissezione occhi degli adulti per un totale di 10 minuti. Lasciare gli occhi a fissare per altri 30 minuti. Rimuovere la soluzione di fissare e condurre lavaggi come descritto nella dissezione del cervello adulto. </li><li> Se si desidera infine l&#39;immagine della struttura ommatidial dell&#39;occhio della lamina deve essere rimosso subito. Ritorno gli occhi fissi al vostro piatto dissezione e rimuovere tutte le cellule della trachea o grasso che potrebbe essere ancora fissato. Poi, mentre si tiene la parte esterna dell&#39;occhio con una pinza, rimuovere la lamina con l&#39;altra. Dovrebbe venire fuori in un solo pezzo, esponendo il cellbodies sotto (Fig. 1B). Fare attenzione a prendere la lamina solo! Altrimenti, si rischia di staccare i fotorecettori della retina. </li><li> Utilizzando un pipetteman P20, muovere gli occhi per 400uL PBS-Triton in un tubo 500uL. Delicatamente roccia a 4 gradi durante la notte per rimuovere il pigmento rosso autofluorescenti dai fotorecettori. Il giorno seguente, si può scartare la soluzione di lavaggio e aggiungere la soluzione primaria di anticorpi. </li><li> Per l&#39;imaging dal vivo degli occhi adulti utilizziamo solo mosche adulte pharate, cioè pupe tardo stadio poco prima eclosion. In questa fase, gli organi fotorecettori cella separata dai terminali in lamina durante la dissezione. </li><li> Pharate adulti pupe sono ben definite le ali, occhi, e cuticola visibile attraverso il caso pupa. Selezionare una pupa e rimuovere la parte anteriore del case pupa per esporre la regione della testa. Rimuovere con attenzione la sottile membrana interna che racchiude inoltre il volano di sviluppo. Prendete la base della testa con il forcipe e tirare. Scartare il resto della pupa, mantenendo la testa sott&#39;acqua. </li><li> Procedere come dimostrato nella dissezione occhio per immunoistochimica. Allo stadio adulto pharate, però, i corpi cellulari dei fotorecettori si staccherà più facilmente dalla lamina, che consente di immagine i corpi cellulari immerso nella retina. Inoltre, la lamina rimane attaccato al lobo ottico, che consente di immagine della lamina distale. Se si desidera l&#39;immagine della lamina prossimale, dove le cartucce fotorecettore terminale può essere visto, quindi eseguire la dissezione occhio su una mosca adulta in cui la lamina è più fortemente attaccato agli occhi. </li></ol> 5. Sviluppare occhio-cervello disco complessi <ol><li> Il disco occhio sviluppo al 20% dello sviluppo pupa (P +20%) è diventato un favorito per l&#39;imaging dal vivo nel nostro laboratorio, perché questo singolo strato di cellule in sviluppo relativamente grande è facilmente osservabile usando la microscopia confocale 3. </li><li> Per selezionare un 20% di pupa, cercare i tubuli malpighiani, una macchia verde le appare sotto il caso pupa ed evitare pupe che hanno un &quot;corpo nero&quot; 4. Dopo aver selezionato un P +20% pupa, è immergere in HL3 nel vostro piatto sezionare e rimuovere una porzione anteriore del sacco di pupa, facendo attenzione aNon a penetrare la sottile membrana interna. Afferrare la membrana interna con il forcipe e tirare a parte. </li><li> Attentamente ricerca attraverso i contenuti rilasciati per trovare lo sviluppo del cervello e dischi occhio che sono abbastanza importanti (Fig. 1C). Il disco complesso occhio-cervello è facilmente separabili in questa fase della metamorfosi. Isolare il cervello alla base del piatto dissezione. Separare con attenzione il cervello centrale dal lobo ottico. L&#39;ottica del lobo / occhio disco verrà utilizzato nella diagnostica per immagini dal vivo. </li></ol> 6. Vivere Imaging: Al microscopio <ol><li> Se si desidera l&#39;immagine per un breve periodo di tempo in una sola o due soluzioni, si può immagine il tessuto su un vetrino. In questo caso, preparare la slitta dal primo rivestimento della superficie con Sylgard utilizzando le istruzioni del produttore. Luogo 20μL HL3 al centro della diapositiva. Trasportare il tessuto sezionato in 20 l aggiuntivo di HL3 alla diapositiva. Il tessuto non deve MAI essere esposto all&#39;aria. Inoltre, qualsiasi stress o affaticamento dalla manipolazione pipetta o tensione superficiale soluzione deve essere evitato. </li><li> Per l&#39;imaging dal vivo, il tessuto deve essere saldamente fissato con trattamento minimo e di contatto. Siamo saldamente la posizione del cervello usando l&#39;acqua-polimerizzazione GluShield chirurgico colla applicata attraverso un microelettrodo, una tecnica solitamente usata per le preparazioni embrionali per elettrofisiologia 5. Ottenere un elettrodo di vetro, come quelli tirati per le registrazioni elettrofisiologiche. Spezzare la punta e riempire la fine con GluShield utilizzando la pressione dell&#39;aria negativa generata dalla bocca. Rompere solo abbastanza dell&#39;elettrodo che colla può entrare. Ora usate pressione positiva per applicare una piccola quantità di colla sul Sylgard sotto una goccia di HL3. Ora, impostare rapidamente il tessuto sulla colla, mantenendo l&#39;orientamento desiderato per l&#39;imaging dal vivo. Una immersione in acqua-lente può ora essere utilizzato per l&#39;imaging. Se si desidera aggiungere un colorante membrana permeabile, è possibile aggiungere al bagno mentre imaging. </li><li> Usiamo un microscopio confocale a scansione di risonanza che permette l&#39;imaging veloci con 6 ridotto photobleaching. Per l&#39;imaging per lunghi periodi di tempo o di soluzioni di scambio in tutto o in più volte, si usa una camera di perfusione (Harvard IC30 confocale di immagini da camera) che si collega ad una pompa peristaltica perfusione che lentamente soluzione cultura nel tessuto vivo (Fig. 2A). Movimento costante di scambio e di contatto liquido GluShield minimo ridurre l&#39;appiattimento del tessuto che è stato osservato per lunghi periodi di tempo 7. Si noti che per l&#39;imaging di periodi di tempo dello sviluppo, il disco complesso occhio-cervello deve rimanere invariato e deve avere minimo contatto con la colla. </li><li> Utilizzare un vetrino rivestito con una goccia di Sylgard che è rasato per renderla sottile e piatto. Dispensare 20μL HL3 sul centro del vetrino e incollare il tessuto vivo al Sylgard. Generare una guarnizione che permetterà bolle di passare attraverso la camera senza esporre il tessuto vivo di aria (Fig. 2B). La guarnizione deve essere abbastanza spessa per evitare lo schiacciamento del tessuto sottile ma sufficiente a portare il tessuto vicino alla lente del microscopio confocale; usiamo 250μm nel nostro setup. Montare la camera di perfusione, facendo attenzione a mantenere il tessuto completamente sommersa in ogni momento. Iniziare perfusione inizialmente ad un tasso prossimo al 100μL al minuto con una pompa peristaltica. Questa velocità è piuttosto veloce a seconda dello spessore guarnizione che definisce l&#39;altezza della camera. Per l&#39;imaging sulla scala delle ore, potrebbe essere necessario aggiungere 20-hydroxyecdysone e antibiotici, ma non antimicotico ed eseguire perfusione a velocità molto più basse intorno 10μl al minuto. Infine, bolle di ossigeno nel terreno di coltura che alimenta la camera di perfusione. </li></ol> 7. Rappresentante dei risultati: Alla fine del nostro protocollo di video che mostrano un esempio per l&#39;imaging in vivo le cellule fotorecettori di sviluppo utilizzando la preparazione presentati nella sezione 5. Questa preparazione si avvale di Drosophila transgenesi per cellulari specificamente esprimere reporter fluorescente. Nell&#39;esempio riportato, due reporter fluorescenti sono espressi sotto il controllo dei fotorecettori specifici GMR-GAL4 autista 8: la membrana-tag myrRFP e il marcatore endosomale 2xFYVE-GFP 9. Due canali set di dati 3D con un rettangolo di selezione di 70x70x17.5μm e una dimensione di voxel 137x137x700nm (512x512x26) sono stati ottenuti ogni 1 min. Il film mostra un piano selezionato nel tempo in questo set di dati 4D che svela le dinamiche di traffico intracellulare endosomale ed eventi fusione delle vescicole. Immagini rappresentative per la preparazione del tessuto fissato l&#39;occhio e lamina sono mostrati in fig. 3.

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Sonde fluorescenti utilizzato per l'imaging Qui si descrivono i punti di forza ei limiti del sistema di preparazione Drosophila visivo per una selezione di sonde fluorescenti da tre classi: (1) Le sonde che vengono aggiunti a una preparazione tessuto vivo esogena, (2) proteine ​​fluorescenti che sono geneticamente codificate sia dal vivo e immagini fisse, (3) coloranti fluorescenti che vengono aggiunti al tessuto fissato per immunoistochimica. 1. Sonde esogene: Lysotracker Verde DND-26 o Red DND-99 (Invitrogen, Inc.) Questi sono disponibili in commercio a fluorescenza di membrana permeabile composti che si accumulano in comparti fortemente acidificato nella cella, più prominente lisosomi, endosomi tardivi, e autophagosomes. Lysotracker a concentrazioni nanomolari (si utilizzano in genere 50 Nm) penetra il 20% degli occhi disco L3 e P completamente in meno di un minuto. Dal Lysotracker accumula continuamente ed esercita un effetto alcalinizzante, abbiamo un'immagine in meno di 5 minuti. In contrasto con i dischi occhio, Lysotracker non penetra nel cervello senza interruzioni del tessuto. Tuttavia, un'attenta lacerazione della membrana esterna permette la penetrazione di una cella di pochi diametri del lobo ottico. Lysosensor ND-189 (Invitrogen, Inc.) In contrasto con Lysotracker, Lysosensor non si accumula in compartimenti acidificato, ma presenta una maggiore fluorescenza a pH acido. Lysosensor penetrazione che ha caratteristiche molto simili a Lysotracker. Noi utilizziamo Lysosensor ad una concentrazione di 1μM. 2. Sonde geneticamente codificate: Per molti esperimenti di imaging dal vivo, esprimiamo geni taggati con diverse molecole fluorescenti come GFP, TagRFP 10 o il pH-sensibile pHluorin 11 sotto il controllo del sistema di espressione Gal4/UAS binario 12. GAL4 linee che esprimono in fotorecettori sviluppo includono GMR-GAL4 (tutti i fotorecettori) 8 e mDelta0.5-GAL4 (sviluppo di R4 e R7) 13. Diversi sottotipo specifico GAL4-driver linee esistenti che utilizzano diversi promotori Rhodopsin 14. Sonde fluorescenti particolarmente utile nella diagnostica per immagini dal vivo sono proteine ​​photoconvertible. Abbiamo utilizzato con successo Dendra2, un monomerici verde a rosso proteina photoconvertable 15. Si noti che Dendra2 è progettato per essere photoconvertible utilizzando una linea di 488 nm Argon laser. Tuttavia, non siamo in grado di raggiungere la conversione mediante luce visibile blu utilizzando il nostro set-up sia convenzionale o risonanza modalità di scansione confocale. Al contrario, la conversione con laser UV 405 nm è efficiente. 3. Immunoistochimica: Per l'occhio fisso adulto, spesso scegliere falloidina rodamina (Invitrogen, Inc.) o anti-Chaoptin (un fotorecettore-anticorpo specifico 16) per visualizzare la struttura rhabdomeric (Fig. 1A). Un buon modo per analizzare la struttura della cartuccia lamina è quello di combinare anti-chaoptin 16, il marker gliale anti-ebano 17, e anti-sec6 18 (Fig. 1B). Come mostrato in fig. 3, questa combinazione di anticorpi contraddistingue i grandi presinaptico (chaoptin) e postsinaptici (sec6) processi così come glia epiteliali (ebano) nella lamina 19. Assemblaggio della Camera di perfusione Per l'imaging dal vivo, ci avvaliamo di una camera di perfusione che permette lo scambio lento di soluzioni senza disturbare la preparazione dei tessuti. Una dimostrazione di assemblaggio perfusione camera è incluso nel video e schematicamente mostrato nella Figura 2. Assemblaggio della camera di perfusione è illustrato nella fig. 2A. Iniziate che la guarnizione sul primo esemplare, e poi continuare con il montaggio, come mostrato. Lo scopo della guarnizione è quello di creare uno spazio tra la base della camera e il coperchio, uno spazio al cui interno è sigillato il tessuto e attraverso il quale la soluzione del flusso. Lo spazio all'interno della guarnizione deve includere l'ingresso (soluzione entra qui), la preparazione dei tessuti, e l'uscita attraverso il quale la soluzione lascia la camera. Due caratteristiche della guarnizione sono fondamentali: in primo luogo, la guarnizione deve essere abbastanza spessa per il cervello ancora abbastanza sottile per consentire immagini con un obiettivo ad alta risoluzione. Lo spessore guarnizione ideale dipende dal set-up specifici parametri. In secondo luogo, una tacca nella guarnizione offre un vano che consente una bolla di passare senza contattare il campione (Fig. 2B). Immagini al microscopio Usiamo un 63x (apertura 1,3) lente glicerina immersione per la camera di perfusione o un obiettivo 63x immersione in acqua direttamente nel terreno di coltura su una diapositiva. Le lenti glicerina fornire più la distanza di lavoro rispetto alle lenti di petrolio. Noi usiamo un microscopio confocale a scansione di risonanza che analizza a tassi molto più veloce di uno scanner convenzionale (8000 Hz rispetto a 1400 Hz, rispettivamente). Scansione di risonanza permette 3-dimensionale registrazioni nel corso del tempo in modo veloceer telaio tariffe. Inoltre, velocità di scansione più veloce di ridurre significativamente fototossicità laser 6 che è una delle principali preoccupazioni per le scansioni ripetute di tessuto vivo. Un equilibrio di intensità del laser e della tensione PMT (guadagno) deve essere ottenuta per massimizzare il segnale, riducendo al minimo il rumore e photobleaching. Una considerazione importante è che il numero di effetti laser su una data regione è determinata dalla risoluzione e lo zoom. Per esempio, una regione di scelta è stato digitalizzato presso la stessa risoluzione a 256x256, zoom 2x al 512x512, zoom 1x, ma la velocità al massimo possibile di immagini dal vivo è 4 volte più veloce a 256x256, zoom 2x. Per registrare l'attività di rapido movimento compartimenti intracellulari, siamo riusciti a registrare con le seguenti impostazioni: 5 fotogrammi al z-stack al ritmo di uno z-stack per 10 secondi con una velocità di scansione di 8000 Hz e una media di linea 2x. Per le sessioni di imaging lunga sulla scala delle ore, spesso ridurre il frame rate a uno per qualche minuto e scegliere aree più estese come la preparazione è più probabile spostamento. Drosophila sistema dei Anatomy La figura 3 mostra l'anatomia dell'occhio adulto Drosophila (fig. 3A), il cervello adulto (Fig. 3B), e il 20% -25% pupa disco occhio / cervello complesso (Fig. 3C). Figura 3A illustra l'occhio adulto sia con che senza la lamina e le cellule di grasso attaccato. Durante la dissezione occhio adulto, la lamina, che si trova nel centro dell'occhio immerso in una ciotola formata da corpi cellulari del fotorecettore (a sinistra), devono essere rimossi senza interrompere i corpi cellulari sotto (a destra). Per la dissezione del cervello adulto, si dovrebbe essere in grado di distinguere i corpi cellulari dei fotorecettori, la lamina, il lobo ottico, il cervello centrale, e trachea (Fig. 3B). I fotorecettori e trachea devono essere rimossi per questa dissezione lasciando la lamina collegata al lobo ottico. Per facilitare l'identificazione del 20-25% pupa disco occhio / cervello complesso, una immagine dal vivo è presentato in Figura 3C. <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig1.jpg" alt="Diagramma di anatomia neurale che mostra cervello, lobo ottico, corpi cellulari; dissezione della lamina, fotorecettori." data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. (A) del cervello adulto. (B) adulti occhio. (C) 20% -25% pupa complesso eye-disc/brain. <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig2.jpg" alt="Schema di configurazione microfluidica con flusso del campione, lente dell'obiettivo, ingressi, uscite, pompa, guarnizione, base." data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. (A) assemblaggio camera di perfusione e (B) guarnizione di posizionamento rispetto al campione. <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig3.jpg" alt="Immagini al microscopio fluorescente; strutture cellulari, marcatori verde/rosso, confronto sperimentale." data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. (A) colorazione adulti rhabdomere utilizzando anti-chaoptin. (B) lamina colorazione degli adulti con anti-chaoptin (verde, fotorecettori), anti-ebano (rosso, glia), e sec6 (blu, interneuroni).

Attrezzatura speciale: <ol><li> Dissezione Campo di applicazione: Leica Mz12.5 con fotocamera digitale </li><li> Leica TCS SP5 confocale Tandem-Scanner microscopio per la scansione convenzionale e risonante vivere immagini di microscopia, tra cui blu (488 nm), verde (561nm), arancione (594nm) e di vasta rosso (633nm) laser e 63x speciali, 1.4 glicerina e un 63x, 1,3 lenti immersione in acqua. </li><li> Harvard Strumenti confocale Imaging Camera RC-30 e pompa peristaltica modello 720 </li><li> Sutter Pipettare estrattore P-97 </li><li> Software: Amira 5.2, Imaging Visage </li></ol>

preparazione di sviluppo e degli adulti drosophila brains e retina per l&#39;imaging dal vivo

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

Il<em&gt; Drosophila</em&gt; Cervello e il sistema visivo sono ampiamente utilizzati sistemi modello per studiare lo sviluppo neuronale, la funzione e la degenerazione. Qui vi mostriamo tre preparati del cervello e del sistema visivo che coprono la gamma dal disco sviluppo occhio-cervello complesso in via di sviluppo per le pupe occhio individuali e di dissezione del cervello da mosche adulte. Tutti i protocolli sono ottimizzati per la cultura dal vivo dei preparativi. Tuttavia, abbiamo anche presenti le condizioni per l&#39;immunoistochimica tessuto fissato, se del caso. Infine, vi mostriamo le condizioni di imaging dal vivo per queste preparazioni con i convenzionali e risonante di imaging 4D confocale vivere in una camera di perfusione. Insieme, questi protocolli fornire una base per l&#39;imaging in diretta su diverse scale temporali che vanno dai saggi funzionali intracellulare sulla scala dei minuti per i processi di sviluppo o degenerative sulla scala di molte ore.

Questo protocollo descrive tre<em&gt; Drosophila</em&gt; Preparati: 1) la dissezione del cervello adulto, 2) dissezione retina adulti e 3) lo sviluppo di dischi occhio-cervello dissezione complessi. Accento è posto sulle tecniche di preparazione e condizioni speciali per l&#39;imaging dal vivo, anche se tutti i preparati possono essere usati per l&#39;immunoistochimica tessuto fissato.

Preparazione di Sviluppo e degli adulti Drosophila Brains e retina per l&#39;imaging dal vivo

Il cervello e il sistema visivo della Drosophila sono sistemi modello ampiamente utilizzati per studiare lo sviluppo, la funzione e la degenerazione neuronale. In questo lavoro presentiamo tre...

Come fare, in questo video, dimostrerò come preparare campioni di cervello e retina per l'immagineggiamento in tempo reale e per l'immunohistochimica, con un focus sulle cellule fotorecettrici. Per prima cosa, vi mostrerò come prepararsi per le dissezioni del cervello. Successivamente, illustrerò tre diverse dissezioni: il cervello adulto, la retina adulta e l'occhio in via di sviluppo.Per ciascuno di questi, il tessuto può essere fissato per immunohistochimica o immaginato in vita. Infine, descriverò come acquisiamo immagini di tessuti vitali e mostrerò alcuni esempi di imaging in tempo reale mediante microscopia confocale a scansione a risonanza. Cominciamo dunque.Per le sezioni di goodness, sono necessarie pinzette affilate. Utilizzando una pietra per affilare o della carta vetrata molto fine, passare delicatamente le pinzette avanti e indietro su ciascun lato finché le estremità non si incontrano. Per un'affilatura fine, utilizziamo una pietra per affilare standard.Non tratterò qui la tecnica di affilatura, ma dirò che pinzette affilate sono essenziali per dissezioni su organismi vivi. Affiliamo le pinzette ogni giorno per le dissezioni del cervello di adulto. Posizionare le mosche su un tappetino a base di CO2 per anestetizzarle e selezionare il genotipo desiderato.Per le dissezioni dell'occhio, inserire semplicemente la pinzetta nel flacone ed estrarre con cura un'iride, avendo l'accortezza di non rompere la capsula dell'iride. Accartocciare un fazzoletto di carta assorbente e inumidirlo con acqua. Si utilizzerà questo materiale durante la dissezione per rimuovere i detriti dalla pinzetta.Posizionare una bacinella per dissezione sullo stage di un microscopio stereoscopico e riempirla con soluzione HL tre. Tutte le dissezioni verranno eseguite in HL tre per garantire che il tessuto rimanga vivo e in buone condizioni durante la procedura di dissezione. Inoltre, preferisco utilizzare una bacinella per dissezione con un fondo rivestito in Sylgard per proteggere la pinzetta durante la dissezione.Ora, preparare una soluzione fissante. Se si prevede di eseguire un'immunohistochimica, aggiungere 180 microlitri di HL3 in una provetta microcentrifuga da 500 microlitri.Aggiungere 20 microlitri di formaldeide al 37% per ottenere una soluzione di formaldeide al 3,7%. Infine, la corretta posizione della mano è fondamentale per eseguire dissezioni accurate con un buon controllo manuale. Le pinzette saranno stabili e in grado di compiere movimenti controllati e precisi.Posizionare prima la pinzetta sul lato del pollice, quindi abbassare il dito indice in modo che la punta del dito si appoggi sopra. Appoggiare ora il lato della pinzetta sul lato del dito medio e spostarsi verso la bacinella per dissezioni. Stabilire un contatto fisico con la bacinella mediante il pollice e il dito medio, appoggiando contemporaneamente il pollice e il dito medio sulla bacinella.Poggi il polso sulla piastra del microscopio. Così. Durante la dissezione, hai tre punti appoggiati saldamente sulle superfici, e ora è possibile effettuare solo manipolazioni molto sottili della pinzetta.Sul tampone di CO2. Posizionare un insetto adulto con il lato ventrale rivolto verso l'alto e la testa lontana dalla mano. Afferrare il torace appena sotto la testa.Se eseguita correttamente, le zampe e il rostro si estenderanno mentre si osserva al microscopio stereoscopico; afferrare il rostro esteso con la pinzetta per rimuovere la testa, scartare il corpo e immergere la testa. Riemettere a fuoco sulla testa immersa. L'intera dissezione verrà eseguita sotto soluzione.È molto importante tenere sempre la testa con la pinzetta. Altrimenti, la testa galleggerà. E ricordare che una testa in galleggiamento è sempre difficile da recuperare.Se la testa esce dal fuoco durante la dissezione, riposizionarla semplicemente nel piano focale senza regolare il microscopio. Questo compito apparentemente semplice potrebbe risultare difficile all'inizio, ma mantenere la testa a fuoco diventerà più facile con il tempo. Iniziare la dissezione strappando innanzitutto il tessuto connettivo tra il probus e l'occhio.Strappare attraverso l'occhio tenendo saldamente con almeno una pinzetta in ogni momento. Assicurarsi che la punta della pinzetta si trovi appena al di sotto della retina o della cuticola. Per evitare di danneggiare il cervello sottostante, alternare tra sinistra e destra.Usa le pinzette per strappare la retina procedendo verso la parte posteriore della testa. Lo strappo della retina aumenterà la probabilità che la lamina rimanga attaccata al lobo ottico. Durante tutta la dissezione, procedi attorno alla parte posteriori della testa, strappando il cuticolo lungo il percorso, attraversa l'altro occhio e inizia a rimuovere il cuticolo.Finché stai afferrando la cuticola, sai di non stare schiacciando il cervello. Con questo criterio, continua a staccare la cuticola e la retina finché il cervello non viene esposto. Una volta visibile il cervello, puoi iniziare a rimuovere le trachee ad esso attaccate; continua a tirare trachee e cuticola finché il cervello non è isolato.A questo punto, è necessario riposizionare il fuoco sulla parte inferiore della piastra per i passaggi rimanenti dell'acquisizione delle immagini dei terminali dei fotoricettori. È consigliabile mantenere la lamina, ma occorre rimuovere la retina, che contiene i corpi cellulari e il pigmento fortemente autofluorescente. Per fare ciò, tirare con attenzione i residui ramificati dei corpi cellulari senza danneggiare la lamina.Questa è un'abilità più raffinata e richiede pratica. Rimuovere la restante trachea. Poiché il cervello potrebbe altrimenti galleggiare durante i lavaggi con anticorpi notturni, il cervello adulto può essere mantenuto in vita per ore o persino durante la notte utilizzando condizioni che discuterò nella sezione sette. Per l'immunohistochimica, il cervello adulto è ora pronto per essere fissato e posto in formaldeide.Utilizzare una pipetta P20 regolata a cinque microlitri per trasferire il cervello adulto nella soluzione di fissazione già preparata. Continuare a dissezionare i cervelli adulti per 20 minuti, ottenendo così da quattro a dieci cervelli. Lasciare i cervelli in fissazione per ulteriori 40 minuti.Tuttavia, questa durata può variare. Per una colorazione ottimale con l'anticorpo primario, rimuovere la soluzione di formaldeide e lavare i cervelli tre volte per cinque minuti ciascuna con 400 microlitri di una soluzione contenente PBS e 0,4% TRITON X-100, di seguito indicata come PBS Triton. Dopo aver completamente eliminato la soluzione fissante, è possibile aggiungere la soluzione dell'anticorpo primario.Iniziare questa dissezione come descritto per il cervello adulto. Dopo aver immerso la testa e rimescolato il microscopio, iniziare strappando il tessuto connettivo tra il probus e l'occhio sopra il probus. Separare la cuticola dall'occhio. A questo punto, separare la cuticola dalla parte inferiore dell'occhio, procedendo verso la parte posteriore della testa con una pinzetta.Afferrare il centro della parte posteriore della testa per questa dissezione. È accettabile schiacciare il cervello con l'altra pinzetta. Afferrare l'occhio e tirare separando.Lasciare che l'occhio si depositi sul fondo della piastra. La lamina sarà probabilmente ancora attaccata all'occhio e potrà essere utilizzata per l'immagine in vivo delle terminazioni dei fotorecettori provenienti da cellule fotorecettrici completamente integre. Le prossime tre sezioni spiegano come preparare l'occhio per l'immunoeistochimica.Per l'immunohistochimica, spostare l'occhio nella soluzione fissativa. Utilizzando una pipetta P 20 Petman impostata su cinque microlitri, continuare la dissezione degli occhi adulti per un totale di 10 minuti. Lasciare gli occhi in fissazione per ulteriori 30 minuti.Rimuovere la soluzione fissante ed eseguire i lavaggi come descritto nella dissezione del cervello adulto. Se si desidera in seguito analizzare la struttura materiale dell'occhio, questo deve essere rimosso. Ora riposizionare gli occhi fissati nella piastra per dissezione e rimuovere qualsiasi trachea o cellule adipose che potrebbero ancora essere attaccate.Quindi, tenendo il bordo esterno dell'occhio con una pinzetta, rimuovere la lamina con l'altra. La lamina dovrebbe staccarsi in un unico pezzo, esponendo i corpi cellulari sottostanti. Prestare attenzione a prendere solo la lamina; altrimenti si rischia di staccare i corpi cellulari dalla retina.Utilizzando una pipetta P20, trasferire gli occhi in 400 microlitri di PBS con Triton in un tubo da 500 microlitri. Agitare delicatamente a quattro gradi durante la notte per rimuovere il pigmento rosso autofluorescente dai fotoricettori; il giorno seguente, è possibile scartare la soluzione di lavaggio e aggiungere l'anticorpo primario per l'immagineggiamento in vivo di occhi adulti privi della lamina.Utilizziamo esclusivamente moscerini adulti di furetto, ovvero stadi pupali tardivi immediatamente prima dell'ecdisi. A questo stadio, i corpi cellulari dei fotorecettori si separano dai terminali nella lamina durante la dissezione del furetto. I pupi adulti presentano ali, occhi e cuticola ben definiti, visibili attraverso l'involucro pupale.Selezionare una pupa e immergerla in HL tre. Rimuovere la porzione anteriore del caso pupale per esporre la regione cefalica. Rimuovere con attenzione la sottile membrana interna che avvolge ulteriormente la mosca in via di sviluppo.Afferrare la base del capo con le pinzette ed estrarre. Scartare il resto della pupa mantenendo il capo immerso. Procedere come descritto nella dissezione dell'occhio per immunohistochimica allo stadio adulto di fer rate.Tuttavia, i corpi cellulari dei fotoricettori si staccheranno più facilmente dalla lamina, consentendo di ottenere immagini dei corpi cellulari situati nella retina. Inoltre, la lamina rimane attaccata al lobo ottico, permettendo di visualizzare la lamina distale. Se si desidera osservare la lamina prossimale, dove sono visibili i cartucce terminali dei fotoricettori, eseguire la dissezione oculare su una mosca adulta, nella quale la lamina è ancorata all'occhio in modo più robusto.Il disco oculare in via di sviluppo al 20% dello sviluppo della pupa è diventato un campione privilegiato per l'immagine in tempo reale nel nostro laboratorio. Poiché questo singolo strato di cellule in via di sviluppo, relativamente grandi, è facilmente osservabile mediante microscopia confocale. Per selezionare una pupa al 20%, cercare i tubuli di Ian, una macchia verde che appare al di sotto del rivestimento pupale, ed evitare le pupe che presentano un corpo scuro, che si forma dopo il 20% dello sviluppo pupale.Dopo aver selezionato una pupa, immergerla nell'HL3 nella piastra per dissezioni e rimuovere con attenzione una porzione anteriore della borsa puparia, avendo cura di non penetrare la sottile membrana interna. Afferrare la membrana interna con la pinzetta ed estrarla.Cercare attentamente tra il materiale rilasciato per individuare i dischi in via di sviluppo del cervello e dell'occhio, che sono piuttosto evidenti. Isolare il cervello nella parte inferiore della bacinella per dissezioni. Separare con cura il cervello centrale dal lobo ottico.Il complesso disco del lobo ottico I verrà utilizzato per l'immagine in tempo reale. Se si desidera effettuare l'acquisizione per un breve periodo e in una o due soluzioni soltanto, è possibile acquisire il tessuto su un vetrino. In questo caso, preparare il vetrino rivestendone prima la superficie con Sylgard seguendo le istruzioni del produttore.Posizionare 20 microlitri di HL tre al centro del vetrino. Trasferire il tessuto dissezionato in altri 20 microlitri di HL tre sul vetrino. Il tessuto non deve mai essere esposto all'aria.Inoltre, è necessario evitare qualsiasi stress o sollecitazione derivante dalla manipolazione della pipetta. Per l'immagine in tempo reale, il tessuto deve essere fissato saldamente. Ottenere un elettrodo di vetro simile a quelli tirati per le registrazioni elettrofisiologiche.Stacca la punta e riempi l'estremità con la colla usando la pressione negativa generata dalla bocca; stacca solo una quantità sufficiente dell'elettrodo in modo che la colla possa entrare. Ora usa la pressione positiva per applicare una piccola quantità di colla sul bordo di tenuta al di sotto di una goccia di HL three. Immediatamente, posiziona il tessuto sulla colla, mantenendo l'orientamento desiderato per l'acquisizione di immagini in tempo reale.Ora è possibile utilizzare un obiettivo a immersione in acqua per l'acquisizione delle immagini. Se si desidera aggiungere un colorante permeabile alla membrana, è possibile aggiungerlo al bagno. Durante l'acquisizione di immagini per periodi prolungati o per sostituire completamente o più volte le soluzioni, utilizziamo una camera di perfusione collegata a una pompa peristaltica che fa scorrere lentamente la soluzione di coltura sul tessuto vivente.Utilizzare un'immersione ricoperta con una goccia di Sylgard raschiata per renderla sottile e piatta. Dispensare 20 microlitri di HL3 al centro dell'immersione. Applicare il tessuto vivo sulla guida del Sylgard e incollarlo.Generare una guarnizione che permetta alle bolle di passare attraverso la camera senza esporre il tessuto vivente all'aria. La guarnizione deve essere abbastanza spessa da evitare di schiacciare il tessuto, ma sufficientemente sottile da avvicinare il tessuto all'obiettivo del microscopio confocale. Assemblare la camera di perfusione avendo cura di mantenere il tessuto completamente immerso in ogni momento.Pertanto, le sostituzioni della soluzione possono essere effettuate a velocità fino a 100 microlitri al minuto. Per acquisizioni su scala di ore, potrebbe essere necessario aggiungere 20 hydroxy Dyson e antibiotico, ma non antifungino, e procedere con la perfusione a velocità molto più basse, intorno a 10 microlitri al minuto. Inoltre, immettiamo ossigeno sotto forma di bolle nel mezzo di coltura che alimenta la pompa peristaltica.Ora possiedi tutte le competenze necessarie per eseguire con successo la dissezione del cervello e della retina di drosophila. Inoltre, puoi acquisire immagini di dischi oculari in sviluppo vivi o di fotorecettori adulti. Grazie quindi per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.

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