Metastasi di analisi sperimentale

L'obiettivo generale del seguente esperimento è verificare le capacità metastatiche di cellule tumorali umane mediante iniezioni nella vena caudale. In topi immunodeficienti, le cellule vengono preparate per l'iniezione. Successivamente, le cellule vengono iniettate in topi immunodeficienti, nei quali si svilupperanno metastasi polmonari dopo uno o due mesi.

I topi vengono dissecati e le metastasi polmonari sono quantificate e coltivate. I risultati di questo tipo di saggio indicano l'estensione delle metastasi di un particolare tipo di cellula tumorale. Ciao, sono Sonali Mohanty del laboratorio del Dott. LE del Dipartimento di Genetica Biomedica dell'Università di Rochester.

Oggi vi mostreremo un procedimento per eseguire un saggio di metastasi sperimentale. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare la metastasi tumorale. Cominciamo dunque.

Iniziare con cellule cresciute fino a circa il 70% di confluenza; aspirare il mezzo dal piatto e lavare delicatamente una volta con un XPBS. Successivamente, aggiungere due millilitri di tripsina 0,05% inversando. Agitare delicatamente il piatto per favorire il distacco delle cellule.

Osservare le cellule al microscopio mentre si staccano. Aggiungere un volume abbondante di mezzo contenente siero fetale bovino per inibire l'attività della tripsina. Successivamente trasferire in un tubo da 50 millilitri.

Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Una volta determinata la concentrazione, centrifugare a circa 200 ×g per tre minuti senza disturbare il pellet cellulare. Rimuovere con attenzione il mezzo, quindi risospendere in un volume appropriato di soluzione tampone equilibrata di Hank o HBSS per raggiungere una concentrazione finale di circa 5 × 10⁶ cellule per millilitro.

Successivamente, filtrare attraverso un filtro cellulare Falcon da 70 micrometri. Per escludere gli aggregati cellulari più grandi, posizionare la punta della pipetta direttamente sul filtro, collocato sopra un tubo da coltura da cinque millilitri. Espellere rapidamente la sospensione attraverso il filtro nel tubo.

Contare nuovamente le cellule utilizzando il trian blu per determinare la vitalità. La vitalità deve essere superiore al 90% prima dell'iniezione. Successivamente, diluire fino a una concentrazione finale di 2,5 × 10⁶ cellule per millilitro.

Mantenere sul ghiaccio. Afferrare delicatamente la coda di un topo immunodeficiente e inserirla nel contenitore per topi con la schiena contro la fessura e la coda che sporge dall'apertura posteriore. Far scivolare lentamente l'anello verso l'interno lungo la fessura.

Una volta che l'anello ha raggiunto la bocca del topo, fissarlo in posizione. Il topo non deve potersi muovere liberamente, ma deve mantenere una frequenza respiratoria normale. Individuare le vene principali della coda.

Sono presenti quattro vasi sanguigni principali nella coda di un topo. Le arterie si trovano sui lati dorsale e ventrale della coda. Le vene si trovano sui lati laterali.

Aspirare almeno 200 microlitri delle cellule preparate in una siringa da un millilitro. Applicare un ago da 30 gauge e mezzo e spingere fuori eventuali bolle d'aria. Il volume finale nella siringa deve essere di 200 microlitri.

Prepararsi a iniettare nell'estremità distale della coda. In questo modo, se il primo tentativo fallisce, si può utilizzare una regione più prossimale della coda per un secondo tentativo. Dopo aver pulito il sito di iniezione con etanolo al 70%, tirare la coda in modo da renderla dritta.

Tenere la punta con il pollice e sostenere la punta per l'iniezione con l'indice. Inserire l'ago nella vena e iniettare le cellule. Assicurarsi che ago e siringa siano paralleli alla vena durante l'iniezione.

Altrimenti, l'ago perforerà la parete del vaso e le cellule verranno iniettate nei tessuti adiacenti della coda. Rimuovere l'ago se la procedura è andata a buon fine. Il sangue dovrebbe affluire dal sito di iniezione.

Premere una pallina di cotone pulita per facilitare l'uso del filo interdentale e palpare la coda verso l'alto per spingere qualsiasi campione residuo in circolo. Rilasciare il topo dal dispositivo di contenimento e riporlo nella gabbia. Registrare il numero di tentativi di iniezione e il numero di cellule iniettate su un taccuino di laboratorio.

Determinare la vitalità delle cellule dopo l'iniezione. Come in precedenza, questo passaggio fornisce la certezza che le cellule rimangano vive durante tutto il processo di iniezione. Al termine di un esperimento di iniezione, la vitalità delle cellule diminuirà, ma dovrebbe rimanere superiore all'80%. Come passaggio facoltativo, centrifugare le cellule rimanenti e lavare il pellet una volta con PBS.

Quindi congelare i pellet a meno 80 gradi Celsius per analisi future come il western blotting. Per confermare l'espressione genica nei silenziamenti, dopo uno o due mesi, dissezionare i topi per determinare le localizzazioni delle metastasi. Iniziare posizionando il topo eutanasizzato su una stazione di dissezione.

Spruzzare abbondantemente il topo con etanolo. Aprire la gabbia toracica per esporre i polmoni e il cuore. Quindi escinderli con cura e posizionarli in PBS.

Il polmone è il sito primario di metastasi poiché contiene il primo letto capillare che le cellule incontrano. Dopo che sono entrate in circolo, rimuovere il cuore e sciacquare i polmoni in PBS, quindi osservare ciascun lobo del polmone al microscopio stereoscopico. Contare il numero di metastasi rilevabili su entrambi i lati del polmone, quindi sommare i numeri di metastasi polmonari su tutti e quattro i lobi per determinare il numero totale di metastasi polmonari.

Successivamente, isolare singole metastasi polmonari mediante escissione usando forbici. Trasferire ciascuna metastasi in un filtro cellulare da 70 micrometri e tritarla utilizzando l'estremità di un cappuccio sterile per ago. Sciacquare il filtro cellulare con alcuni millilitri di mezzo e raccogliere le cellule che passano attraverso il filtro.

In una piastra di coltura, ogni piastra contiene le cellule provenienti da una singola metastasi. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per almeno quattro giorni senza alcun disturbo. Inizialmente, sia le cellule tumorali che le cellule fibroblastiche cresceranno sulle piastre, ma gradualmente le cellule fibroblastiche andranno incontro a morte e verranno sostituite dalle cellule tumorali.

Se le cellule tumorali portano geni di resistenza ai farmaci, selezionare le cellule con gli antibiotici corrispondenti. Dopo tre giorni, rimuovere con lavaggio qualsiasi residuo ematico o di tessuto, e i detriti sulla piastra con PBS e aggiungere mezzo fresco. Valutare la purezza delle cellule ottenute mediante immunomarcatura con anticorpi contro proteine specifiche umane; in questo caso viene utilizzato un anticorpo anti-menting umano, anche in assenza di selezione farmacologica. Più del 99% delle cellule dovrebbe essere di origine umana.

Le cellule appena ottenute possono ora essere nuovamente iniettate in topi immunodeficienti per verificare le loro capacità metastatiche al termine di questo saggio. Una linea cellulare tumorale altamente metastatica genera tipicamente numerose metastasi polmonari, mentre da una linea cellulare tumorale scarsamente metastatica ne derivano molto poche. Queste immagini mostrano metastasi polmonari due mesi dopo l'iniezione della linea cellulare di melanoma umano.

Un 3 7 5 sm. Le cellule derivate utilizzando questo metodo di solito danno origine a una maggiore metastasi rispetto alla linea parentale quando vengono testate. Utilizzando nuovamente questo saggio, vi abbiamo appena mostrato la procedura per eseguire un saggio di metastasi sperimentale.

Quando si esegue questa procedura, è molto importante ricordare di assicurarsi che le cellule vengano iniettate nella vena della coda, ma non nel tessuto della coda. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.