Metastasi di analisi sperimentale

L'obiettivo generale del seguente esperimento è testare le capacità metastatiche delle cellule tumorali umane mediante iniezioni di vena caudale. Nei topi immunodeficienti, le cellule vengono preparate per l'iniezione. Le cellule vengono quindi iniettate in topi immunodeficienti, che genereranno metastasi polmonari dopo uno o due mesi.

I topi vengono sezionati e le metastasi polmonari vengono quantificate e coltivate. I risultati di questo tipo di test indicano l'entità delle metastasi di un particolare tipo di cellula tumorale. Ciao, sono Sonali Mohanty del laboratorio del Dr.LE's presso il Dipartimento di Genetica Biomedica dell'Università di Rochester.

Oggi vi mostreremo una procedura per eseguire il test sperimentale delle metastasi. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare le metastasi del cancro. Quindi iniziamo.

Iniziare con le cellule cresciute a circa il 70% di co, aspirare il terreno dalla piastra e lavare delicatamente una volta con un XPBS. Quindi, aggiungere due millilitri di tripsina allo 0,05% inversante. Scuotere delicatamente la placca per facilitare il distacco delle cellule.

Osserva le cellule al microscopio mentre si staccano. Aggiungi un ampio volume di media contenenti FBS per spegnere i viaggi in attività. Quindi trasferire in una provetta da 50 millilitri.

Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Una volta determinata la concentrazione, centrifugare a circa 200 volte la gravità per tre minuti senza disturbare il pellet della cella. Rimuovere con cautela il terreno Resus sospendendo un volume appropriato della soluzione tampone dell'equilibrio di Hank o HBSS per raggiungere una concentrazione finale di circa cinque volte 10 per sei cellule per millilitro.

Quindi, filtrare attraverso un colino per celle Falcon's da 70 micrometri. Per escludere aggregati cellulari di grandi dimensioni, posizionare la punta della pipetta direttamente sul filtro, posta sopra una provetta di coltura da cinque millilitri. Espellere rapidamente la sospensione attraverso il filtro nel tubo.

Conta di nuovo le cellule usando il trian blue per determinare la vitalità. La vitalità deve essere superiore al 90% prima dell'iniezione. Quindi diluire a una concentrazione finale di 2,5 volte 10 per sei cellule per millilitro.

Mantenere il ghiaccio. Afferra delicatamente la coda di un topo immunodeficiente e tiralo nel sistema di ritenuta del topo con la schiena contro la fessura e la coda che sporge dalla piccola apertura nella parte posteriore. Far scorrere lentamente l'anello verso l'interno lungo la fessura.

Una volta che l'anello cattura la bocca del topo, bloccalo in posizione. Il mouse non dovrebbe essere in grado di muoversi liberamente, ma dovrebbe avere una frequenza respiratoria normale. Trova le principali vene della coda.

Quattro vasi sanguigni principali sono presenti in una coda di topo. Le arterie si trovano sui lati dorsale e ventrale della coda. Le vene si trovano sui lati laterali.

Aspirare almeno 200 microlitri delle cellule preparate in una siringa da un millilitro. Attacca un mezzo ago calibro 30 e spingi fuori eventuali bolle d'aria. Il volume finale nella siringa deve essere di 200 microlitri.

Prepararsi a iniettare nell'estremità distale della coda. Quindi, se il primo tentativo fallisce, una regione più prossimale della coda potrebbe essere utilizzata per un secondo tentativo. Dopo aver pulito il sito di iniezione con etanolo al 70%, tirare la coda dritta.

Tenere la punta con il pollice e sostenere la punta per l'iniezione con l'indice. Inserire l'ago nella vena e iniettare le cellule. Assicurarsi che l'ago e la siringa siano paralleli alla vena durante l'iniezione.

In caso contrario, l'ago penetrerà attraverso la parete del vaso e le cellule verranno iniettate nei tessuti della coda adiacenti. Ritirare l'ago se la procedura è andata a buon fine. Il sangue deve fuoriuscire dal sito di iniezione.

Premere un batuffolo di cotone pulito per facilitare l'uso del filo interdentale e palpare la coda verso l'alto per spingere in circolo il campione residuo. Rilasciare il mouse dal sistema di ritenuta e rimetterlo nella gabbia. Registrare il numero di prove di iniezione e il numero di cellule iniettate in un quaderno di laboratorio.

Determinare la vitalità delle cellule dopo l'iniezione. Come in precedenza, questa fase fornisce la rassicurazione che le cellule rimangano in vita durante tutto il processo di iniezione. Alla fine di un esperimento di iniezione, la vitalità delle cellule diminuirà, ma dovrebbe rimanere al di sopra dell'80%Come passaggio facoltativo, centrifugare le cellule rimanenti e sciacquare i pellet con PBS una volta.

Quindi congelare i pellet a meno 80 gradi Celsius per analisi future come il western blotting. Per confermare l'espressione genica sui knockdown Dopo uno o due mesi, sezionare i topi per determinare le posizioni delle metastasi. Inizia posizionando il topo soppresso su una stazione di dissezione.

Spruzzare generosamente il mouse con etanolo. Taglia la gabbia toracica per esporre i polmoni e il cuore. Quindi asportarli con cura e metterli in PBS.

Il polmone è il sito principale per le metastasi poiché contiene il primo letto capillare che le cellule incontrano. Dopo che sono entrati in circolazione, rimuovere il cuore e sciacquare i polmoni in PBS, quindi osservare ogni lobo del polmone al microscopio da dissezione. Contare il numero di metastasi rilevabili su entrambi i lati del polmone, quindi il numero di metastasi polmonari su tutti e quattro i lobi insieme per determinare il numero totale di metastasi polmonari.

Successivamente, isolare le singole metastasi polmonari mediante escissione utilizzando le forbici. Trasferire ogni metastasi in un colino cellulare da 70 micrometri e tritarla utilizzando l'estremità di un cappuccio sterile per ago. Sciacquare il filtro cellulare con diversi millilitri di terreno e raccogliere le cellule che passano attraverso il filtro.

In una piastra di coltura, ogni piastra contiene le cellule di una metastasi. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per almeno quattro giorni senza disturbi. Inizialmente, sia le cellule tumorali che le cellule dei fibroblasti cresceranno sulle piastre, ma gradualmente le cellule dei fibroblasti si estingueranno e saranno sostituite dalle cellule tumorali.

Se le cellule tumorali sono portatrici di geni resistenti ai farmaci, selezionare le cellule con gli antibiotici corrispondenti Dopo tre giorni, lavare via eventuali detriti di sangue o tessuti, detriti sul piatto con PBS e aggiungere terreno fresco. Valutare la purezza delle cellule derivate mediante immunocolorazione con anticorpi contro proteine specifiche umane e l'anticorpo anti-mento umano viene utilizzato anche in assenza di selezione del farmaco. Più del 99% delle cellule dovrebbe essere umano.

Le cellule appena derivate possono ora essere iniettate nuovamente in topi immunodeficienti per testare le loro capacità metastatiche alla fine di questo test. Una linea cellulare tumorale altamente metastatica in genere dà origine a molte metastasi polmonari, mentre pochissime metastasi polmonari provengono da una linea cellulare tumorale scarsamente metastatica. Queste immagini mostrano metastasi polmonari due mesi dopo l'iniezione della linea cellulare di melanoma umano.

A 3 7 5 mq. Le cellule derivate con questo metodo di solito danno origine a più metastasi rispetto alla linea parentale quando vengono testate. Sempre utilizzando questo test, vi abbiamo appena mostrato la procedura per eseguire il test sperimentale delle metastasi.

Quando si esegue questa procedura, è molto importante ricordare di assicurarsi che le cellule vengano iniettate nella vena della coda, ma non l'it e il tessuto della coda. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.