Name: Metastasi di analisi sperimentale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-24T17:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Impara l'analisi della metastasi sperimentale per valutare il potenziale metastatico delle cellule tumorali umane mediante iniezioni nella vena caudale di topi immunodeficienti. Questo metodo consente di quantificare e coltivare le metastasi polmonari.

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Questo protocollo è stato testato e ottimizzato inizialmente in laboratorio del Dr. Richard Hynes (MIT). Il finanziamento è fornito dalla PREMIO IDEA NYSTEM (a LX) e Ruth L. Kirschstein Premio Nazionale Research Service (a LX).

1. Preparazione del campione <ol><li> Crescere le cellule a confluenti ~ 70% nelle loro supporto specifico con fattori di crescita o FBS (ad esempio, con DMEM 10% FBS per MC-1 le cellule). Aspirare multimediali da piastra e lavare delicatamente più volte con 1 x PBS (8 g / L di NaCl, 0,2 g / L di KCl, 1,15 g / L di Na 2 HPO 4 0,7 H 2 O, 0,2 g / L di KH 2 PO 4, pH 7,3). </li><li> Aspirare il PBS e aggiungere 2 ml di tripsina 0,05% a versene (0,014 g / L di rosso fenolo e 0,2 g / L di EDTA-Na in 1 x PBS, pH 7,2). Scuotere delicatamente piastra per facilitare il distacco delle cellule dalla piastra. Osservare le cellule al microscopio. Di solito ci vogliono 2-5 minuti per le cellule di staccare. </li><li> Aggiungere un ampio volume di supporti contenenti FBS (o inibitori della tripsina di soia) per estinguere l'attività tripsina e raccogliere le cellule in una provetta da 50mL falco. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Carico 10μL di sospensione cellulare su un emocitometro pulito. Il numero di cellule per ml è pari alla media # delle cellule in ciascuna delle cinque piazze moltiplicato per 10 4. </li><li> Centrifugare le cellule a 1000 RPM (o ~ 200 xg) in una centrifuga da banco per 3 minuti. </li><li> Rimuovere con attenzione i media senza disturbare il pellet. Risospendere le cellule in un volume adeguato di soluzione tampone Hanks bilanciata (HBSS) per raggiungere una concentrazione finale di circa 5 x 10 6 cellule / ml. </li><li> Celle filtranti attraverso un filtro 70 micron cellula Falcon per escludere aggregati a grandi cellule. Posizionare la punta della pipetta direttamente sul filtro su un etichetta 5mL tubo cultura Falcon. Espellere rapidamente la sospensione attraverso il filtro nel tubo di cultura. </li><li> Contare le celle di nuovo con un emocitometro e diluire ad una concentrazione finale di 2,5 x 10 6 / ml. Mantenere le cellule in ghiaccio. </li><li> Determinare la vitalità delle cellule. Mescolare alcune cellule con trypan blu e misurare la percentuale di morti (blu), le cellule sulle celle totale utilizzando un emocitometro. La vitalità delle cellule dovrebbe essere ≥ 90% prima dell'iniezione. </li></ol> 2. Iniezione per via endovenosa <ol><li> Cambiare i guanti. Delicatamente afferrare la coda di un topo immunodeficienti (nudo, NOD-SCID, o NSG, Laboratorio di Jackson) e tirarlo nel dispositivo di immobilizzazione mouse, con le spalle contro la fessura e la sua coda spuntava la piccola apertura nella parte posteriore del dispositivo di immobilizzazione . </li><li> Lentamente scivolare l'anello verso l'interno lungo la fessura e bloccarla in posizione una volta che l'anello di cattura della foce del mouse. Il mouse non dovrebbe essere in grado di muoversi liberamente, ma deve avere ritmo normale di respirazione. </li><li> Trova le vene coda importante. Quattro vasi sanguigni più importanti sono presenti in una coda di topo. I vasi sanguigni sui lati dorsale e ventrale della coda sono arterie. Vene sono sui lati laterali della coda. </li><li> Disegna più di 200 ml di cellule preparato in una siringa da 1 ml. Applicare l'ago 30 G1 / 2 pollice e spingere fuori le bolle d'aria che possono esistere. Il volume finale di cellule della siringa deve essere 200 ul (cioè, 5 x 10 5 cellule in totale). </li><li> Iniettare cellule nella vena della coda. <ol class="lalpha"><li> Inizio dalla fine distale della coda, quindi se la prima prova fallisce, una regione più prossimale della coda potrebbe essere usata per un secondo tentativo. </li><li> Pulire la coda con il 70% di etanolo. Tirare la coda dritta. Tenere la punta della coda con il pollice e sostenere il punto di iniezione con il dito indice. </li><li> Inserire l'ago nella vena e iniettare le cellule. Assicurarsi che l'ago e la siringa sono paralleli alla vena durante l'iniezione, altrimenti l'ago si colpire attraverso la parete del vaso e iniettare le cellule nei tessuti adiacenti coda. </li><li> Ritirare l'ago dopo l'iniezione. Il sangue dovrebbe profuso dal sito di iniezione se l'iniezione è andato con successo. Premere un pezzo pulito di carta assorbente o tampone di cotone sul sito di iniezione per facilitare la coagulazione, e palpare la coda verso l'alto per spingere qualsiasi campione residuo nella vena in circolazione. </li><li> Rilasciare il mouse dal dispositivo di immobilizzazione e restituirlo alla gabbia. Registrare il processo di iniezione (per esempio, quante prove ci sono voluti per iniettare le cellule e quanto le cellule sono state iniettate) in un quaderno di laboratorio. </li><li> Determinare la vitalità delle cellule dopo l'iniezione, come descritto nella Sezione di preparazione del campione, punto 9. Questa operazione fornisce rassicurazione che le cellule rimanere in vita durante tutto il processo di iniezione. Alla fine di un esperimento di iniezione, la vitalità delle cellule diminuirà, ma deve essere superiore a 80%. </li><li> (Opzionale) Spin giù le cellule rimanenti e lavare il pellet una volta con PBS. Congelare il pellet a -80 ° C per le analisi future (ad esempio, Western blot per confermare l'espressione genica o atterramenti). </li></ol></li><li> Di solito dopo uno o due mesi, i topi saranno sezionati e le posizioni delle metastasi sono grossolanamente determinati. Polmonare è il sito primario per le metastasi, in quanto contiene il primo letto capillare che le cellule incontrano dopoentrano nella circolazione. </li><li> Dopo il risciacquo con PBS, ogni lobo del polmone (o di altri tessuti contenenti metastasi) viene osservato con un microscopio da dissezione (Figura 1). Il numero di metastasi rilevabili su entrambi i lati del polmone e viene contato il numero di metastasi polmonari su tutti i quattro lobi si sommano come il numero totale delle metastasi polmonari 1. Metastasi al polmone sono più facilmente rilevabili se i polmoni sono fissati in formalina durante la notte , in quanto la metastasi si apppear come macchie biancastre in contrasto con la adiacente marrone scuro tessuti polmonari. </li></ol> 3. Cellule coltura da metastasi polmonari <ol><li> Metastasi polmonari sono isolati da topi iniettati. Ognuno dovrebbe essere coltivato separatamente. </li><li> Ogni metastasi viene macinata per la fine di un cappuccio (sterile) su un filtro 70 micron cellulare. </li><li> Sciacquare il filtro cella con alcuni ml di medio e cellule raccolte che passano attraverso il filtro in un piatto cultura. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C per almeno quattro giorni senza disturbo. </li><li> Lavare via il sangue o frammenti di tessuto sul piatto con PBS. </li><li> Aggiungi un mezzo fresco. All'inizio, sia le cellule tumorali e cellule di fibroblasti crescono sulle piastre, ma a poco a poco, le cellule di fibroblasti morirà e sarà sostituito da cellule tumorali. Se le cellule tumorali trasportare qualsiasi geni resistenti ai farmaci, selezionare le celle con antibiotici corrispondente. </li><li> La purezza delle cellule derivate viene valutata mediante immunocolorazione utilizzando anticorpi umani contro proteine ​​specifiche. Usiamo un anticorpo anti-umano vimentina (NCL-VIM-V9, Novocastra). Le cellule che contengono derivati ​​tipicamente oltre il 99% di cellule umane, anche in assenza di selezione dei farmaci. Le cellule di nuova derivazione potrebbe essere iniettato nuovamente in topi immunodeficienti per testare le proprie capacità metastatica, come descritto sopra. </li></ol> 4. Rappresentante Risultati <ol><li> Alla fine di questo saggio, una linea di cellule altamente metastatico cancro al solito dà origine a metastasi polmonari molti (Figura 1), 1 mentre le metastasi polmonari pochissimi arriveranno da una linea del cancro metastatico delle cellule male. </li><li> Le cellule derivate con questo metodo di solito danno luogo a metastasi più rispetto alla linea dei genitori, quando vengono testati di nuovo da questo test. 1-3 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1942/1942fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Immagini Rappresentante dei polmoni del mouse dopo iniezioni coda vena delle cellule tumorali. 5 x 10 5 della linea di cellulari di melanoma metastatico umano, le cellule SM, 4 sono stati iniettati nella vena caudale di topi immunodeficienti. Due mesi più tardi, i polmoni sono stati isolati e le metastasi sono stati trovati sparsi tra il tessuto polmonare normale.

<ol><li>Xu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+changes+in+an+animal+melanoma+model+correlate+with+aggressiveness+of+human+melanoma+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Gene expression changes in an animal melanoma model correlate with aggressiveness of human melanoma metastases.</a> Mol Cancer Res. 6 (5), 760-760 (2008).</li>
<li>Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+metastasis+reveals+an+essential+role+for+RhoC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC.</a> Nature. 406 (6795), 532-532 (2000).</li>
<li>Xu, L., Begum, S., Hearn, J. D., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPR56%2C+an+atypical+G+protein-coupled+receptor%2C+binds+tissue+transglutaminase%2C+TG2%2C+and+inhibits+melanoma+tumor+growth+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">GPR56, an atypical G protein-coupled receptor, binds tissue transglutaminase, TG2, and inhibits melanoma tumor growth and metastasis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (24), 9023-9023 (2006).</li>
<li>Kozlowski, J. M., Hart, I. R., Fidler, I. J., Hanna, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+melanoma+line+heterogeneous+with+respect+to+metastatic+capacity+in+athymic+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">A human melanoma line heterogeneous with respect to metastatic capacity in athymic nude mice.</a> J Natl Cancer Inst. 72 (4), 913-913 (1984).</li>
<li>Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multigenic+program+mediating+breast+cancer+metastasis+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone.</a> Cancer Cell. 3 (6), 537-537 (2003).</li>
</ol>

Metastasi è la principale causa di morte nei pazienti oncologici. Si tratta di quattro fasi principali: il distacco delle cellule tumorali dal loro loci primaria, la loro entrata in circolazione (intravasation), la loro uscita dalla circolazione (stravaso), e la sopravvivenza e la crescita in un organo lontano. Metastasi in umano è considerato un processo lento e spesso si manifesta dopo anni di latenza. Per studiare la sua progressione in modo tempestivo, quanto sopra relativamente rapido test sperimentale è stato stab...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10313-021</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30088.03</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>6838-04</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>7896-04</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>7100-12</td><td></td></tr><tr><td>Rosso fenolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-Na</td><td>EMD Millipore</td><td>4010</td><td></td></tr><tr><td>Blu di tripano</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina 2,5%</td><td>Invitrogen</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Etilene</td><td>Ultrapuro</td><td>200-CSGP</td><td></td></tr><tr><td>Provetta Falcon da 50 ml</td><td>VWR international</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare Falcon da 70&amp;mu;m</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per coltura Falcon da 5 ml</td><td>VWR international</td><td>60818-576</td><td></td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td>Hausser Scientific</td><td>15170-208</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 1 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>329650</td><td></td></tr><tr><td>Ago da 30 &amp;frac12; gauge</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo di contenimento per topo</td><td>Plas Labs Inc.</td><td>551-BSRR</td><td></td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-902</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio stereoscopico</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga da banco</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>75003491</td><td></td></tr></tbody></table>

metastasi di analisi sperimentale

Experimental Metastasis Assay

Metastasi è la principale causa di morte nei pazienti oncologici. Per capire il meccanismo di metastasi, un test sperimentale metastasi è stata stabilita utilizzando topi immunodeficienti. Questo articolo delinea le procedure coinvolte in questo test, compresa la preparazione del campione, l&#39;iniezione endovenosa, coltura e le cellule di metastasi polmonari. In breve, un pre-determinato numero di cellule tumorali umane sono state preparate<em&gt; In vitro</em&gt; E iniettato direttamente nella circolazione di topi immunodeficienti attraverso le loro vene coda. Un piccolo numero di cellule di sopravvivere alle turbolenze nella circolazione e crescere come metastasi in organi interni, come quello al polmone. I topi iniettati vengono sezionati dopo un certo periodo. La distribuzione tissutale delle metastasi è determinato sotto un microscopio da dissezione. Il numero di metastasi in un tessuto specifico è contato e si correla direttamente con la capacità metastatica delle cellule tumorali iniettate. Le metastasi sono sorti isolate e coltivate<em&gt; In vitro</em&gt; Come linee cellulari, che spesso mostrano una maggiore capacità metastatica rispetto alla linea parentale quando iniettato nuovamente in topi immunodeficienti. Questi derivati ​​altamente metastatico diventare strumenti utili per identificare geni o pathway molecolari che regolano la progressione metastatica.

In questo articolo vengono descritte le procedure di un test metastasi sperimentale che viene utilizzato per determinare il potenziale metastatico di linee cellulari tumorali umane.

Metastasi di analisi sperimentale

La metastasi è la principale causa di morte nei pazienti oncologici. Per comprendere il meccanismo della metastasi, è stato stabilito un saggio di metastasi sperimentale...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è verificare le capacità metastatiche di cellule tumorali umane mediante iniezioni nella vena caudale. In topi immunodeficienti, le cellule vengono preparate per l'iniezione. Successivamente, le cellule vengono iniettate in topi immunodeficienti, nei quali si svilupperanno metastasi polmonari dopo uno o due mesi.I topi vengono dissecati e le metastasi polmonari sono quantificate e coltivate. I risultati di questo tipo di saggio indicano l'estensione delle metastasi di un particolare tipo di cellula tumorale. Ciao, sono Sonali Mohanty del laboratorio del Dott. LE del Dipartimento di Genetica Biomedica dell'Università di Rochester.Oggi vi mostreremo un procedimento per eseguire un saggio di metastasi sperimentale. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare la metastasi tumorale. Cominciamo dunque.Iniziare con cellule cresciute fino a circa il 70% di confluenza; aspirare il mezzo dal piatto e lavare delicatamente una volta con un XPBS. Successivamente, aggiungere due millilitri di tripsina 0,05% inversando. Agitare delicatamente il piatto per favorire il distacco delle cellule.Osservare le cellule al microscopio me

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