Cronico Salmonella Modello mouse infetti

L'obiettivo generale di questa procedura è stabilire un modello murino cronico infetto da salmonella. Ciò si ottiene preparando prima una soluzione di salmonella. Il secondo passo della procedura consiste nel mettere il gavaging ai topi con streptomicina, seguita da salmonella o solo con streptomicina.

Il terzo passo della procedura consiste nell'isolare la salmonella dalla materia fecale di topo e rilevare l'infezione da salmonella nell'intestino del topo utilizzando piastre BL chroma. La fase finale della procedura consiste nell'osservare e registrare la massa corporea del topo e notare i cambiamenti nella vitalità a seguito dell'infezione da salmonella. In definitiva, si possono ottenere risultati che dimostrano che un'infezione da salmonella può essere stabilita nell'intestino di topi con salmonella.

Ciao, sono Michelle P del laboratorio del Dr.Johnson nel Dipartimento di Medicina dell'Università di Rochester. Anch'io vengo dal Sun Lab e sono Y del Sun Lab. Oggi vi mostreremo una procedura per stabilire il modello di massa infettato da Alytic Lennar.

Utilizziamo questa procedura nel nostro travaglio per studiare l'interazione con i batteri ospiti, la trasduzione del segnale e la genesi del tumore. Quindi iniziamo. Prima di sperimentare, preparare abbastanza piastre da brodo luria, berti o LB per ogni ceppo di salmonella e da utilizzare durante l'esperimento.

I piatti possono essere refrigerati e conservati per diversi mesi. Quindi, prepara la coltura della salmonella. Togliete una fiala di salmonella congelata a meno 80 gradi Celsius e lasciatela scongelare sul piano di lavoro per impiattare la fiamma della salmonella.

Un anello di inoculazione in un panini e bruciatore e immergere nel brodo batterico scongelato. Zigzaga l'anello avanti e indietro sul terzo superiore della piastra LB. Fiammare di nuovo l'anello e ruotare la piastra.

Zigzaga l'anello per attraversare le strisce precedenti e diffondere i batteri sul secondo terzo della piastra. Ripeti ancora una volta. Fiammare di nuovo il ciclo.

Non lasciare che l'anello penetri nell'agar. Lascia crescere le colonie conservando le piastre in un'incubatrice a 37 gradi Celsius durante la notte. Se fatto correttamente, la piastra per la salmonella dovrebbe produrre singole colonie in almeno una sezione.

Il giorno dopo. Prelevare un clone dalla piastra LB utilizzando uno stuzzicadenti sterile o un'ansa batterica e inserirlo in sette millilitri di LB in una provetta da 12 millilitri. Agitare il tubo a 37 gradi Celsius per circa cinque ore.

Utilizzare 0,05 millilitri di questa coltura per inoculare. 50 millilitri di LB in una provetta Falcon. Incubare a 37 gradi Celsius senza agitare per circa 18 ore.

Centrifugare la coltura batterica da 50 millilitri durante la notte a temperatura ambiente a 5.000 giri/min per 10 minuti e scartare il surnatante. Quindi, aggiungere 1,5 millilitri di soluzione salina tamponata di Hank o HBSS al tubo per risospendere i batteri o 100 parti di libbra in tre parti di HBSS. Quindi portare il volume totale a 15 millilitri con HBSS o un rapporto da uno a 10 tra LB e HBSS.

Ogni topo richiede 100 microlitri di coltura di salmonella diluita, o tra una volta 10 e sei e una volta 10 e otto unità formanti colonie prima di iniziare il prelievo di acqua e cibo dai topi quattro ore prima della sperimentazione. Quindi preparare una soluzione di streptomicina immediatamente prima della sonda gastrica diluendo 7,5 milligrammi di streptomicina in polvere in 100 microlitri di HBSS. Per ogni topo iniettato, assicurarsi di preparare un po' di volume extra per tenere conto della perdita prima del gavage del topo.

Per prima cosa, prepara un ago per l'alimentazione con 100 microlitri di soluzione di streptomicina. Rimuovi il primo topo dalla gabbia per ricevere il gavage e tieni il mouse rivolto verso il piano del banco. Afferra saldamente la pelle sopra la spalla del mouse con il pollice e il medio, allungando la testa e il collo con l'indice per rendere l'esofago dritto.

Dirigere la punta sferica dell'ago di alimentazione lungo il palato e verso il lato destro della parte posteriore della faringe. Quindi passarlo delicatamente nell'esofago e iniettare i 100 microlitri di soluzione di streptomicina. Non si deve avvertire alcuna resistenza.

Ripetere questo processo per tutti i topi sperimentali e di controllo in fase di sperimentazione. Dopo circa 20 ore dopo la traslazione e la sonda gastrica e quattro ore prima della sonda sonda salmonella, prelevare acqua e cibo dai topi che riceveranno la sonda sonda salmonella per via orale. Mettere il gavaging a ciascun topo nello stesso modo di prima, utilizzando 100 microlitri di soluzione di salmonella in HBSS.

Dopo il gavage, trasferisci ogni topo in una nuova gabbia per iniziare la raccolta delle feci. A partire da circa otto ore dopo il gavagaggio, rimuovere la materia fecale dalla gabbia subito dopo la caduta. Raccogli 100 milligrammi di materia fecale di topo come campione sperimentale.

Raccogliere campioni giornalmente o settimanalmente a seconda della durata dello studio per l'analisi della salmonella della materia fecale. Trasferire il campione fecale in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri con un millilitro di PBS e centrifugare energicamente per 10 minuti a 800 giri/min. Trasferire il surnatante in una centrifuga pulita da 1,5 millilitri a 6.000 giri/min per cinque minuti.

Scartare il surnatante e aggiungere 200 microlitri di PBS al vortice di pellet per risospendere. Quindi, rilevare la salmonella con una piastra BB l. Utilizzare da 10 a 100 microlitri di soluzione di materia fecale per piastra, distribuendola sulla piastra, come mostrato nella seconda sezione.

Le specie di salmonella appaiono di colore marco a causa delle differenze metaboliche nella presenza di cromogeni selezionati. Conta le colonie di salmonella sulla piastra per confrontare il livello di infezione tra i singoli topi. In questa procedura sperimentale abbiamo utilizzato femmine di C 57 nere prive di patogeni specifici di sei topi di età compresa tra sei e sette settimane.

I topi sono stati infettati con salmonella e streptomicina più HBSS. I topi sono stati controllati con streptomicina solo i ceppi di salmonella utilizzati includono il ceppo wild type di salmonella typhimurium, A TCC 1 4 0 2 8 S FP C, ceppo mutante di salmonella non patogeno e tre ceppi FPC dal laboratorio del Dr.James Madera che trasportano il gene AAV R age associato alla virulenza in PSKW 29, plasmide a bassa copia. Utilizzando questo protocollo, la colonizzazione da salmonella tyrian può essere rilevata nell'intestino del topo.

L'infezione cronica da salmonella è stata misurata mediante analisi della materia fecale e sono stati raccolti campioni di peso corporeo e tessuto intestinale per la colorazione immunofluorescente. In genere, la perdita di peso corporeo e la morte si verificano entro quattro settimane dall'infezione. Le proporzioni di sopravvivenza quattro settimane dopo l'infezione sono mostrate qui.

Una volta che i topi sopravvivono quattro settimane dopo l'infezione, i topi aumentano di peso corporeo e gli incidenti di morte diminuiscono nelle restanti 23 settimane. Complessivamente, oltre il 65% dei topi ha infettato con ceppi di salmonella, FSY fsy, A VRA null o fsy. Un eterozigote VRA può sopravvivere per oltre sei mesi con un'infezione persistente da salmonella nell'intestino.

Dopo l'infezione acuta, i sopravvissuti erano ancora portatori di salmonella, che poteva essere rilevata sei mesi dopo l'infezione utilizzando il metodo descritto in questo protocollo. L'analisi in immunofluorescenza di campioni di tessuto provenienti dall'intestino di topo mostra l'invasione di salmonella nella mucosa intestinale a 27 settimane dopo l'infezione. In questa immagine, i nuclei sono colorati di blu e le salmonelle infette sono mostrate in verde.

Come mostrato nel gruppo di controllo, non c'è colorazione verde brillante, il che indica che non c'è colonizzazione da salmonella. Mentre nei topi infetti da salmonella a 27 settimane dopo l'infezione, c'è una colorazione verde brillante nella mucosa intestinale. Ciò dimostra la persistenza dell'infezione da salmonella nel topo pretrattato con streptomicina.

Abbiamo appena mostrato come indurre l'infezione cronica di alcuni nel modello murino. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di preparare un po' di cultura fresca per il garage, correggere le abilità del garage e rilevare l'esistenza di ANA per assicurarsi che il modello dell'esperimento funzioni. Quindi questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.