Name: Floreale-dip Trasformazione Arabidopsis thaliana Per esaminare PTSO2:: β-glucuronidasi Reporter espressione genica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-11T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Impara il metodo floral-dip per trasformare Arabidopsis thaliana con il gene reporter GUS. Questa tecnica permette di visualizzare l'espressione genica in piante transgeniche per studi di biotecnologia vegetale.

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Ringraziamo Chunxin Wang per la costruzione di pTSO2:: GUS e per le foto in figura 1, Detlef Weigel per la condivisione del GUS-infallibile protocollo, Paja Sijacic, e Courtney Hollender per gli utili commenti. La ricerca in laboratorio, Z. L s è supportato dal US National Science Foundation (IOB0616096 e MCB0744752). ZL è parzialmente supportata dalla University of Maryland Stazione esperimento agricola.

I. floreale-dip trasformazione di Arabidopsis thaliana <ol><li> Circa 1 mese prima trasformazione, seminare i semi di Arabidopsis sul 4-8 pentole (5 vasi pollice quadrato), con circa 10-15 piante per vaso. Per gli impianti con la fertilità normale, 4 vasi di piante per costruire plasmide sarà sufficiente. Se uno ha a trasformare Arabidopsis mutante con riduzione della fertilità, aumentare il numero di vasi di conseguenza. </li><li> Le piante sono coltivate in condizioni standard (16 ore di luce e 8 ore al buio a 22 ° C). Se le piante sono coltivate in brevi giorno o abbassare la temperatura, che richiederà più tempo a fiorire e più tempo per essere pronti per la trasformazione. La cura delle piante buona volontà assicurare piante sane, che sono essenziali per la trasformazione di successo. </li><li> Quando le piante hanno appena cominciato a imbullonati e fiori. Essi sono ora pronti per la trasformazione. Per aumentare l'efficienza della trasformazione, 3-4 giorni prima della trasformazione, tagliare i tralci principali infiorescenza non appena sono imbullonati per incoraggiare la formazione di scattare più secondario. Annaffiare le piante il giorno prima trasformazione. Questo assicura che il terreno non assorbire i media infiltrazione troppo durante floreali-immersione. </li><li> Due giorni prima della trasformazione, inoculare LB 40ml contenenti antibiotici appropriati (nel caso di pTSO2:: GUS, 50 mg / ml kanamicina) con Agrobacterium tumefaciens ceppo GV3101 porta la pTSO2:: GUS costruire. La pTSO2:: GUS è clonato nel vettore pBIN20 che possiede gene nptII che conferisce resistenza alla kanamicina 3. Crescere durante la notte in una agitazione incubatore a 28-30 ° C. </li><li> Il giorno seguente, 8ml trasferimento della cultura durante la notte in 400 ml di LB contenente 50 mg / ml kanamicina. Crescere durante la notte in una agitazione incubatore a 28-30 ° C. </li><li> Il giorno della trasformazione, quando il diametro esterno 600 della cultura Agrobacterium raggiunge circa 0,8 (OD 600 tra 0,5 a 1 sono accettabili), spin down la cultura Agrobacterium pernottamento per 8 minuti a 5000rpm. </li><li> Risospendere il pellet Agrobacterium in 1 L (litri) di media infiltrazione (10mM MgCl 2, 5% di saccarosio, 0.44mM 6-benziladenina (BA), 0,3% Silwet L-77, soluzione di vitamina 1x Gamborg s acqua e autoclave). Il mezzo non ha bisogno di essere sterilizzati in autoclave, ma deve essere fatta fresca. Versare la L 1 Agrobacterium contenente medio infiltrazione in un piatto (come 8 "x15" x2 "piatto di vetro Pyrex). </li><li> Invertire il vaso (piante non cadere) e tuffo tutte le parti aeree delle piante nella soluzione infiltrazione, tenere premuto per 5 minuti un piatto alla volta. Mentre tutte le parti aeree della pianta sono immersi nel mezzo infiltrazione, evitare di lasciare assorbire il terreno dei media infiltrazione per ridurre le possibilità di proliferazione di funghi sul terreno. </li><li> Dopo l'immersione, luogo immerso tutte le pentole al loro fianco in diversi strati di carta assorbente in un vassoio. I tovaglioli di carta assorbire quantità accesso dei mezzi di infiltrazione. Coprire il vassoio con pellicola trasparente per assicurare elevata umidità. Collocare il vassoio in camera di crescita delle piante. </li><li> Il giorno seguente, rimuovere l'involucro di plastica e tovaglioli di carta, pentole e posto in posizione verticale. Non acqua queste piante per quattro o cinque più giorni. In seguito, mantenere le piante in genere fino a quando non impostare semi e raccogliere i semi alla rinfusa. </li><li> Versare nelle piastre (150x15mm capsula di Petri), con media MS contenente 50 mg / ml kanamicina (peso 2.2g Murashige e Skoog sale basale senza vitamina, sciogliere in 500 ml di acqua, il pH a 5,8 con NaOH 1M, aggiungere 4 grammi di agar, autoclave, fresco e aggiungere kanamicina a 50 mg / ml concentrazione finale). Le piastre sono tenuti in 4 ° C fino al momento dell'uso. </li><li> Per selezionare le piante transgeniche resistenti agli antibiotici, bisogna schermo 20.000 semi al minimo. 0,1 grammi è di circa 5000 semi. Peso e stimare la quantità di semi. </li><li> Sterilizzare i semi di lavarli in 15 ml di tubo Falcon con il 70% di etanolo per 30 secondi. Lavare i semi con acqua sterile una volta. Mettere a bagno i semi per 30 secondi in una soluzione contenente diluizione 1:10 del negozio-acquistato candeggina al 5% (candeggina). Sciacquare i semi con acqua sterile tre a sei volte. Nel cappuccio sterile, pipetta circa 5000 semi su ogni (kanamicina) piastra SM, diffondere i semi in modo uniforme sul piatto, sigillare le piastre con nastro adesivo 3M Micropore per evitare contaminazioni. </li><li> Incubare le piastre a 4 ° C al buio per 3-4 giorni, poi trasferire le piastre di una camera (potrebbe essere la stessa camera di crescita delle piante). Dopo circa 14 giorni, piantine transgeniche soggiorno verde ma la non-transgenico quelli si stanno rivolgendo pallido e morente. Trasferire le piantine transgeniche al suolo rallentando tirando le radici fuori dal mezzo e li pose nel suolo. </li></ol> II. Esaminando pTSO2:: pattern di espressione GUS <ol><li> Vendemmia pTSO2:: GUS piantine transgeniche e metterli in acetone freddo il 90% in un flacone di vetro o tubi di scintillazione microcentrifugache vengono tenuti in ghiaccio. Micropiastre di polistirene (non polipropilene) può essere utilizzato anche se si analizza un numero elevato di campioni. </li><li> Dopo che tutti i campioni vengono raccolti, posto le fiale a temperatura ambiente per 20 minuti. Durante questo periodo compongono tampone fresca colorazione senza x-Gluc (0,2% Triton X-100, 50mm NaHPO 4 Buffer pH7.2, 2mM ferrocianuro di potassio, 2mM ferricianuro di potassio) e posto sul ghiaccio. </li><li> Rimuovere acetone dai campioni e aggiungere la soluzione tampone colorazione. </li><li> Make up x-Gluc soluzione colorante (0,2% Triton X-100, 50mm NaHPO 4 Buffer pH7.2, Potassio Ferrocianuro 2mM, 2mM ferricianuro di potassio, 2mm x-Gluc). Rimuovere il tampone colorazione da campioni e aggiungere la soluzione tampone contenente colorazione x-Gluc ai campioni. </li><li> Infiltrati i campioni sotto vuoto per 15 a 20 minuti. Rilasciare lentamente il vuoto e verificare che tutti i campioni affondare sotto la superficie della soluzione colorante. Se necessario, ripetere l'infiltrazione fino a quando tutti affondare campioni dopo il vuoto è stato rilasciato. </li><li> Campioni incubare a 37 ° C per una notte nel buffer di colorazione con x-Gluc. </li><li> Rimuovere i campioni da incubatore e rimuovere buffer di colorazione. Lavare i campioni in serie successive di etanolo (20%, 35% e 50% di etanolo) a temperatura ambiente per 30 minuti ogni modifica. </li><li> Fissare i tessuti in FAA fissativo (50% etanolo, 5% di formaldeide, 10% di acido acetico, acqua riposo) per 30 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere FAA e aggiungere etanolo al 70%. A questo punto i tessuti possono essere visualizzati e fotografato con un microscopio da dissezione dotato di una fotocamera digitale. Un colore blu scuro indica dove TSO2 è espressa (Figura 1). In alternativa, i tessuti possono essere conservati a 4 ° C per una visione successiva. <img src="/files/ftp_upload/1952/1952fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 pTSO2:.: Espressione di GUS in piantine transgeniche (A), radici laterali (B), e la punta della radice (C). Si noti che TSO2 promotore è molto attivo nei tessuti giovani e dividendo. Il pattern di espressione sporadici in (C) è tipica di geni espressi in specifiche fasi del ciclo cellulare. </li></ol> Rappresentante Risultati Se fatto correttamente, l'efficienza della trasformazione dovrebbe essere di circa 0,1-0,2%. In un'altra parola, si dovrebbe avere 50-10 piantine transgeniche attraverso lo screening ogni 5000 semi. In media, circa 100 linee transgeniche può essere ottenuto trasformando 4 vasi di piante wild-type. Per le piantine transgeniche contenenti il pTSO2:: GUS costruire 3, colore blu scuro che riflette l'attività GUS si trova nelle cellule in divisione attiva tra giovani foglie, all'apice sparare, punta della radice, e laterale radice primordi (Figura 1). La non uniforme modello sporadiche è caratteristico del ciclo cellulare fase-specifici espressione.

<ol><li>Clough, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Floral+dip%3A+agrobacterium-mediated+germ+line+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Floral dip: agrobacterium-mediated germ line transformation.</a> Methods Mol Biol. 286, 91-91 (2005).</li>
<li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Floral+dip%3A+a+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 16 (6), 735-735 (1998).</li>
<li>Wang, C., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+ribonucleotide+reductases+are+critical+for+cell+cycle+progression%2C+DNA+damage+repair%2C+and+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis ribonucleotide reductases are critical for cell cycle progression, DNA damage repair, and plant development.</a> Plant Cell. 18 (2), 350-350 (2006).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;efficienza di trasformazione è determinato da molti fattori diversi, che sono discussi di seguito: <ol><li> La salute delle piante e la loro età sono di primaria importanza. Circa un mese impianti di produzione di numerose gemme floreali immaturi sono l&#39;ideale. Taglio fuori spara primario di incoraggiare secondaria giornate di formazione sparare 3-4 prima della trasformazione aumenterà l&#39;efficienza della trasformazione. Vecchi impianti darà origine a trasformanti ma ad un tasso inferiore. </li><li> Fer...

<table><tbody><tr><td>6-benziladenina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>852430</td><td></td></tr><tr><td>Silwet-77</td><td>Crompton Corp.</td><td></td><td>Tossico, indossare guanti</td></tr><tr><td>Mezzo basale di Murashige e Skoog (MS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5519</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione vitaminica di Gamborg&amp;rsquo;s 1000X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1019</td><td></td></tr><tr><td>X-Gluc (sale di cicloesilammina del 5-bromo-4-cloro-3-indolil &amp;#946;-D-glucuronide)</td><td>Biosynth International, Inc</td><td>B-7300</td><td>Tossico, sensibile alla luce, conservare al buio</td></tr><tr><td>Nastro Micropore 3M</td><td>Fisher Scientific</td><td>19027761</td><td></td></tr></tbody></table>

floreale-dip trasformazione arabidopsis thaliana per esaminare ptso2:: β-glucuronidasi reporter espressione genica

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

La possibilità di introdurre geni estranei in un organismo è il fondamento della biologia moderna e le biotecnologie. Nella pianta fiorita modello<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt;, I fiori-dip trasformazione del metodo<sup&gt; 1-2</sup&gt; Ha sostituito tutti i metodi precedenti per la sua semplicità, efficienza e basso costo. In particolare, i germogli di fioritura giovani<em&gt; Arabidopsis</emPiante&gt; sono immersi in una soluzione di<em&gt; Agrobacterium tumefaciens</em&gt; Trasporto specifico costruisce plasmide. Dopo l&#39;immersione, le piante vengono restituiti alla crescita normale e semi di resa, una piccola percentuale dei quali sono trasformate con il gene estraneo e possono essere selezionati per il supporto contenente antibiotici. Questo floreali-dip metodo significativamente facilitato<em&gt; Arabidopsis</emDi ricerca&gt; e ha contribuito notevolmente alla comprensione della funzione dell&#39;impianto gene. In questo studio, si usa il floreali-dip metodo per trasformare un gene reporter,<em&gt; Β-glucuronidasi (GUS)</em&gt;, Sotto il controllo di<em&gt; TSO2</em&gt; Promotore.<em&gt; TSO2</em&gt;, Che codifica per la ribonucleotide reduttasi (RNR) subunità piccola<sup&gt; 3</sup&gt;, È un gene del ciclo cellulare regolata essenziale per la biosintesi dNDP nella fase S del ciclo cellulare. Esame della<em&gt; GUS</emEspressione&gt; in transgenico<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Piantine mostra che<em&gt; TSO2</em&gt; È espressa in modo attivo divisione tessuti. Il metodo riportato sperimentale e materiali può essere facilmente adattato non solo per la ricerca ma anche di istruzione alle scuole superiori e livelli di college.

Questo articolo illustra la floreali-dip metodo di<em&gt; Agrobacterium tumefaciens</em&gt;-Mediata trasformazione del<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt;. Con l&#39;introduzione di un ciclo cellulare regolata promotore-reporter,<em&gt; PTSO2:: β-glucuronidasi (GUS)</em&gt;, In<em&gt; Arabidopsis</em&gt;, Ci illustra come si rileva giornalista espressione GUS in piantine transgeniche.

Floreale-dip Trasformazione Arabidopsis thaliana Per esaminare PTSO2:: β-glucuronidasi Reporter espressione genica

La capacità di introdurre geni estranei in un organismo costituisce il fondamento della biologia e della biotecnologia moderne. Nella pianta modello a fiore Arabidopsis ...

Il metodo del bagno floreale viene utilizzato per trasformare piante di arabidopsis con un costrutto reporter. Le piante transgeniche risultanti vengono quindi analizzate per l'espressione del gene reporter. Innanzitutto, giovani piante di arabidopsis in fiore vengono immerse in una soluzione di agrobatterio contenente il costrutto reporter.Successivamente, le piante vengono riportate alle normali condizioni di crescita fino a quando producono semi, una piccola percentuale dei quali sarà trasformata con il gene estraneo. Il terzo passaggio della procedura consiste nel raccogliere i semi dalle piante e seminarli su un mezzo selettivo contenente antibiotici. Infine, vengono esaminati i germogli che crescono sul mezzo selettivo con antibiotici.I getti transgenici che contengono il gene estraneo sono resistenti agli antibiotici e sopravvivono, mentre i getti non transgenici diventano gradualmente bianchi e muoiono. L'espressione del gene marcatore nei getti transgenici viene osservata colorando questi ultimi con il substrato del gene marcatore e analizzando le cellule e i tessuti al microscopio stereoscopico. Ciao, sono Chloe Mara del laboratorio della dottoressa Zou del Dipartimento d

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