Selezione di Aptamers per β-amiloide proteina, l'agente eziologico della malattia di Alzheimer

L'obiettivo generale degli esperimenti di selezione è selezionare molecole di RNA che si legano in modo specifico e con alta affinità a una proteina bersaglio nell'RNA Selects. Ciò si ottiene mediante trascrizione in vitro di RNA da una libreria di oligonucleotidi di DNA randomizzati, seguita dall'incubazione del pool di RNA trascritto con la proteina bersaglio. Come secondo passaggio viene utilizzato un filtro di legame.

Questo separa le molecole di RNA bersaglio leganti dal pool di RNA non legato. Successivamente, le molecole di RNA bersaglio leganti vengono eluite. Trascritte al contrario in DNA, amplificate mediante PCR e nuovamente trascritte in RNA.

Questo pool di RNA, che ora è arricchito per alcuni aptameri leganti, viene utilizzato per il legame con la sequenza bersaglio nel ciclo successivo di selezione. Generalmente, dopo otto a venti cicli, vengono selezionati e caratterizzati aptameri specifici per la sequenza bersaglio con elevata avidità. Ciao, sono Gal Bean del Dipartimento di Neurologia presso l'UCLA oggi, Far Rahimi.

Un postdottorato senior del mio laboratorio illustrerà un processo chiamato cellex. Abbiamo utilizzato questo processo in laboratorio per selezionare abers specifici per gli oligomeri del peptide amiloide-beta. Cominciamo dunque.

Per la lettura, è tutto vostro. In questo esperimento selezionato, vengono preparati legamenti proteici stabili, omogenei e privi di aggregati, costituiti dalla proteina amiloide beta A beta 40, utilizzando la procedura di prelievo descritta in un precedente protocollo video di Jove, con modifiche dettagliate nel protocollo scritto allegato. Dopo il cross-linking, purificate la miscela di legamenti cross-linkati utilizzando colonne di desalazione da cinque millilitri.

Posizionare innanzitutto la colonna su un supporto con un becher al di sotto dell'uscita della colonna. Rimuovere il tappo superiore dalla colonna ed estrarre il tappo dell'uscita. Lasciare scorrere il buffer di conservazione e raccoglierlo nel becher.

Successivamente, equilibrare la colonna con cinque volumi della resina in aliquote di tre millilitri di acetato di ammonio 10 millimolare a pH 8,3. Dopo aver equilibrato la colonna, applicare una aliquota di 0,5 millilitri della miscela di reazione di prelievo sulla colonna. Lasciare assorbire la miscela proteica nella resina e scartare il flusso iniziale.

Nel becher, posizionare il primo tubo di raccolta al di sotto dell'uscita della colonna. Aggiungere 0,5 millilitri del tampone acetato sulla colonna e raccogliere la prima frazione di 0,5 millilitri in uscita. Ripetere l'eluzione per raccogliere frazioni da 8,5 millilitri nei tubi corrispondenti.

I campioni vengono caratterizzati mediante elettroforesi SDS-PAGE e misura dell'assorbanza. Unire le frazioni con il contenuto proteico più elevato e mescolare delicatamente utilizzando una pipetta, come descritto nel protocollo scritto. Conservare un'aliquota di 10 microlitri per l'analisi degli amminoacidi e immagazzinare il resto.

Successivamente, preparare la miscela di RNA. Iniziare amplificando la libreria sintetica di DNA a singolo filamento mediante PCR, come descritto nel protocollo scritto allegato. Purificare il prodotto di DNA amplificato e verificare la quantità di DNA mediante elettroforesi su gel all'2%.

In genere, la concentrazione e il rendimento del DNA sono di 160 più o meno 10 nanogrammi per microlitro in 50 microlitri per provetta. Successivamente, effettuare la trascrizione in vitro del DNA in presenza di CTP radioattivo durante la notte, seguita dalla digestione del template di DNA amplificato mediante DNA per quattro ore al fine di generare una popolazione di RNA marcato con P 32, come descritto dettagliatamente nel protocollo scritto allegato. Sebbene il produttore Promega raccomandi un'incubazione di 15 minuti con DNAs, nei nostri esperimenti abbiamo riscontrato che un'incubazione di quattro ore determina la rimozione completa di tutto il template di DNA dopo l'incubazione con d ns.

Estrarre l'RNA aggiungendo un volume di fenolo cloroformio saturato con citrato, cloroformio, alcool isoamilo, vorticare per circa un minuto e centrifugare a 16.000 G per due minuti a temperatura ambiente; dopo la centrifugazione, trasferire la fase acquosa superiore in una provetta nuova. Utilizzando una micropipetta, aggiungere un volume di cloroformio alcool isoamilo, vorticare per un minuto e centrifugare. Come in precedenza, rimuovere la fase inferiore per aspirazione utilizzando una micropipetta.

Si noti che in questo passaggio è più semplice rimuovere la fase inferiore piuttosto che quella superiore. La fase inferiore viene scartata come rifiuto. Successivamente, precipitare l'RNA aggiungendo un volume equivalente pari a 0,1 di acetato di sodio 3 M e un volume equivalente di isopropanolo.

Mescolare e posizionare in un congelatore a meno 20 gradi Celsius per 15 minuti. Dopo 15 minuti, centrifugare, aspirare il soprannatante e lavare il pellet di RNA con 0,5 millilitri di etanolo al 70%. Dopo il lavaggio con etanolo, centrifugare nuovamente e scartare l'etanolo. Asciugare il pellet di RNA a 37 gradi Celsius per cinque minuti in un blocco termoregolato, quindi sciogliere il campione di RNA in tampone STE 150 millimolare pH 8,0 fino a un volume identico a quello della reazione di trascrizione in vitro.

Riscaldare il tubo contenente il prodotto di RNA a 70 gradi Celsius per 10 minuti in un blocco riscaldante ed eseguire un vortex. Per favorire la solubilizzazione dell'RNA, centrifugare alla velocità massima per un minuto a temperatura ambiente; conservare un microlitro di RNA per il conteggio con scintillazione e per l'elettroforesi su gel di poliacrilamide in urea per TPE. Dopo la solubilizzazione dell'RNA, rimuovere i nucleotidi non incorporati utilizzando colonne G 50, seguendo le istruzioni del produttore.

Ricordarsi di conservare un microlitro dell'RNA purificato con G 50 per il conteggio con contatore a scintillazione e per l'elettroforesi su gel denaturante. Utilizzare le due aliquote da un microlitro di RNA ottenute rispettivamente dalla precipitazione dell'RNA e dal passaggio di desalazione con G 50 per il conteggio con contatore a scintillazione. Dopo il conteggio con contatore a scintillazione e il calcolo della percentuale di incorporazione, calcolare la resa dell'RNA e l'attività specifica dell'RNA.

Esaminare infine l'RNA prima e dopo la purificazione su colonna G-50 eseguendo i campioni su un gel di poliacrilamide al 6% TBE con urea e visualizzando l'RNA mediante autoradiografia, come descritto nel protocollo scritto allegato. Se si è soddisfatti della qualità del prodotto marcato, procedere mescolando la libreria di RNA con il campione proteico per i selezionamenti. Incubare la soluzione di RNA a 90 gradi Celsius per 10 minuti per la denaturazione, quindi a temperatura ambiente per 10 minuti per una rinaturazione lenta.

Mentre l'RNA è in incubazione, sciogliere un tubo di proteina in otto microlitri di idrossido di sodio 60 millimolare più 36 microlitri di acqua deionizzata priva di nucleo. Sonicare il miscuglio per un minuto e aggiungere 36 microlitri di buffer di legame per RNA 2X. Per il controllo negativo.

Combinare l'RNA con 20 microlitri di buffer di legame 10 XRNA e portare il volume a 200 microlitri aggiungendo acqua priva di nucleasi. Per la reazione di legame, combinare 20 microlitri di proteina e la miscela di RNA con 20 microlitri di buffer di legame 10 XRNA e portare il volume a 200 microlitri con acqua priva di nucleasi.

Incubare le provette per 30 minuti a temperatura ambiente; mentre i campioni sono in incubazione, preparare i filtri e il sistema di filtrazione. In primo luogo, collegare un pallone con bocca laterale da 125 millilitri all'ingresso del vuoto. Posizionare un supporto in vetro poroso, preventivamente pulito, per il filtro sul pallone con bocca laterale.

Successivamente, equilibrare tre membrane filtranti in due-tre millilitri di un tampone di legame XRNA in una piastra di Petri da 35 per 10 millimetri per 10-15 minuti. Una volta terminata l'incubazione dei campioni di controllo negativo e delle reazioni di legame, centrifugarli alla velocità massima per cinque minuti. A temperatura ambiente, procedere accendendo il vuoto e posizionare la prima membrana sul vetro poroso; utilizzando una micropipetta, aggiungere per gocciolamento 0,5 millilitri di tampone di legame per RNA sulla membrana.

Regolare il vuoto in modo da permettere un flusso lento di ciascuna goccia di tampone attraverso la membrana. Questo primo filtro viene utilizzato esclusivamente per regolare l'aspirazione a vuoto. Successivamente, posizionare la seconda membrana sul vetro poroso e, mantenendo la stessa velocità di flusso, applicare il controllo negativo sulla membrana.

Dopo aver applicato il campione, lavarlo quattro volte con aliquote di 0,5 millilitri di un tampone di legame XRNA. Rimuovere la membrana del controllo negativo e posizionarla in un tubo per il conteggio della scintillazione. Sostituire il vetro poroso con un secondo supporto di vetro poroso pre-pulito.

Posizionare il terzo disco sulla superficie di vetro poroso ed applicare la miscela di reazione per il legame. Lavare il filtro come appena mostrato; il numero di lavaggi può essere aumentato nei cicli di selezione successivi. Per aumentare la stringenza delle condizioni di selezione, rimuovere il disco filtrante e collocarlo in un tubo da 1,6 millilitri etichettato come reazione di legame.

Eseguire il conteggio mediante scintillazione per entrambi i filtri. Calcolare il livello di radioattività legata ai filtri rispetto alla quantità totale di radioattività applicata alle membrane. Questo fornisce un'indicazione dell'arricchimento del legame man mano che la selezione procede.

Dopo il conteggio con scintillazione, rimuovere il filtro della reazione di legame dal tubo e posizionarlo in una capsula di Petri pulita e asciutta di 35 per 10 millimetri. Utilizzando un bisturi pulito e una pinzetta, tagliare la membrana in piccoli pezzi. Usare la pinzetta per trasferire i pezzi tagliati nuovamente nel vial di scintillazione.

Aggiungere 400 microlitri di buffer di eluizione e incubare il tubo a 95 gradi Celsius per 10 minuti. Al termine dei 10 minuti, mescolare mediante vortex e centrifugare il tubo alla velocità massima a temperatura ambiente; aspirare e raccogliere il buffer di estrazione in un nuovo tubo etichettato. Misurare i conteggi di radioattività residui nel tubo contenente i pezzi di membrana mediante conteggio a scintillazione. Per valutare l'efficienza di estrazione, ripetere l'estrazione per tre volte; l'efficienza dopo tre estrazioni è solitamente del 95-96%. Successivamente, aggiungere tre o quattro microlitri di glicogeno come co-precipitante dell'RNA ed estrarre e precipitare l'RNA rilasciato dal filtro come mostrato in precedenza, tranne per il fatto che il campione deve essere posto in un congelatore a meno 20 gradi Celsius per tutta la notte.

Dopo l'incubazione notturna, centrifugare il campione: l'RNA precipita in una fase liquida appena visibile. Aspirare con attenzione il sovranatante senza perturbare questa fase precipitata appena visibile sul fondo del tubo. Lavare il pellet di RNA con 0,5 millilitri di etanolo al 70%, centrifugare per cinque minuti alla velocità massima a quattro gradi Celsius e rimuovere l'etanolo per aspirazione senza disturbare la fase precipitata appena visibile.

Sciogliere il pellet di RNA in 50 microlitri di buffer STE e procedere alla purificazione su G 50 come descritto per l'RNA appena trascritto nel protocollo scritto allegato. Per passare al ciclo successivo di selezioni, effettuare la trascrizione inversa dell'RNA in DNA seguita dall'amplificazione PCR come descritto nel protocollo scritto allegato. Ricordare di includere un campione di controllo negativo privo della trascrittasi inversa.

Verificare i prodotti della PCR su un gel se la corsia del controllo negativo è vuota e le altre corsie sono come previsto. Procedere quindi con la trascrizione e l'etichettatura dell'RNA come mostrato in precedenza per l'utilizzo. Nel ciclo successivo della selezione, raccogliere l'oligomero generato.

Una proteina beta 40 utilizzata in questi esperimenti è stata purificata come mostrato in questo protocollo video e successivamente analizzata mediante misurazioni di assorbanza indicate dal tracciato rosso e da SDS-PAGE. La proteina eluisce costantemente dalla colonna nelle frazioni tre, quattro e cinque, mentre il reagente di cross-linking saluta dopo la frazione sei, indicato da un aumento dell'assorbanza nella frazione sette. L'SDS-PAGE mostra la tipica distribuzione del legame della proteina beta 40.

L'integrità dell'RNA per ogni ciclo di selezione è importante per il progresso iterativo delle selezioni. Dopo la trascrizione e la marcatura dell'RNA, la qualità dell'RNA marcato viene valutata mediante elettroforesi su gel denaturante. Questo è un profilo tipico di un prodotto di RNA marcato integro prima e dopo la purificazione G 50. Il template di DNA contaminante dai cicli di selezione precedenti, ancora presente dopo la reazione di trascrizione in vitro, potrebbe ridurre l'efficacia della selezione, richiedendo un numero maggiore di cicli.

L'elettroforesi agarosio della reazione di trascrizione inversa seguita da amplificazione PCR mostra il prodotto di DNA previsto; l'assenza di prodotto di DNA nei tubi di reazione del controllo negativo indica la rimozione con successo del template di DNA mediante trattamento con DNAasi dopo la trascrizione in vitro. Ok, abbiamo appena mostrato come selezionare abers per oligomeri di amiloide beta 40 stabilizzati covalentemente mediante foto-cross-linking. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che entrambe le molecole devono possedere una struttura stabile per garantire un'elevata affinità e che entrambe presentano una struttura tridimensionale attraverso la quale interagiscono.

Bene, è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.