Name: Selezione di Aptamers per β-amiloide proteina, lagente eziologico della malattia di Alzheimer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 23 s
Description: Scopri la selezione di aptamer per la proteina β-amiloide legata alla malattia di Alzheimer. Questo metodo dimostra l'evoluzione in vitro di molecole RNA ad alta affinità per applicazioni diagnostiche e terapeutiche.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni AG030709 dal NIH / NIA e 07-65798 del California Department of Public Health. Riconosciamo Margaret M. Condron per la sintesi di peptidi e analisi degli aminoacidi, la dottoressa Elizabeth F. Neufeld per aiutare e sostenere i passi iniziali del progetto, il Dr. B. Chi-Hong Chen di sostegno e di reagenti e Dr. Andrew D . Ellington per le discussioni utili.

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<li>Bibby, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+novel+in+vitro+selection+technique+to+isolate+and+characterise+high+affinity+DNA+aptamers+binding+mammalian+prion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Application of a novel in vitro selection technique to isolate and characterise high affinity DNA aptamers binding mammalian prion proteins.</a> J. Virol. Methods. 151, 107-115 (2008).</li>
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<li>King, D. J., Safar, J. G., Legname, G., Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioaptamer+interactions+with+prion+proteins%3A+sequence-specific+and+non-specific+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Thioaptamer interactions with prion proteins: sequence-specific and non-specific binding sites.</a> J. Mol. Biol. 369, 1001-1014 (2007).</li>
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<li>Luhrs, T., Zahn, R., Wuthrich, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+formation+by+recombinant+full-length+prion+proteins+in+phospholipid+bicelle+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Amyloid formation by recombinant full-length prion proteins in phospholipid bicelle solutions.</a> J. Mol. Biol. 357, 833-841 (2006).</li>
<li>Bunka, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+characterization+of+RNA+aptamers+specific+for+amyloid+fibril+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Production and characterization of RNA aptamers specific for amyloid fibril epitopes.</a> J. Biol. Chem. 282, 34500-34509 (2007).</li>
<li>Ylera, F., Lurz, R., Erdmann, V. A., Furste, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+RNA+aptamers+to+the+Alzheimer%27s+disease+amyloid+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Selection of RNA aptamers to the Alzheimer's disease amyloid peptide.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 290, 1583-1588 (2002).</li>
<li>Rahimi, F., Murakami, K., Summers, J. L., Chen, C. H., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+aptamers+generated+against+oligomeric+A%CE%B240+recognize+common+amyloid+aptatopes+with+low+specificity+but+high+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">RNA aptamers generated against oligomeric Aβ40 recognize common amyloid aptatopes with low specificity but high sensitivity.</a> PLoS ONE. 4, e7694-e7694 (2009).</li>
<li>Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+%CE%B2-protein+oligomerization%3A+prenucleation+interactions+revealed+by+photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Amyloid β-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins.</a> J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).</li>
<li>Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins+%28PICUP%29+applied+to+amyloidogenic+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Photo-induced cross-linking of unmodified proteins (PICUP) applied to amyloidogenic peptides.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotoxic+protein+oligomers-what+you+see+is+not+always+what+you+get%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Neurotoxic protein oligomers-what you see is not always what you get.</a> Amyloid. 12, 88-95 (2005).</li>
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<li>Takahashi, T., Tada, K., Mihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+aptamers+selected+against+amyloid+%CE%B2-peptide+%28A%CE%B2%29+inhibit+the+aggregation+of+A%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">RNA aptamers selected against amyloid β-peptide (Aβ) inhibit the aggregation of Aβ.</a> Mol. Biosyst. 5, 986-991 (2009).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il punto di partenza del processo di SELEX è sintesi di una libreria oligonucleotide casuale tipicamente contiene 10 12 -10 15 sequenze. Nel DNA SELEX, questa libreria è utilizzata direttamente dopo un pool di ssDNA viene generato, mentre in RNA SELEX, dimostrato qui, la biblioteca ssDNA viene convertito prima a un pool di RNA enzimaticamente da trascrizione in vitro. Poi, SELEX viene eseguito iterativamente per cui ogni ciclo comprende l&#39;esposizione e vincolante di oligonucleotidi per...

<table><tbody><tr><td>A&amp;#946;40</td><td>Laboratorio Biopolimeri UCLA</td><td></td><td>Polvere liofilizzata</td></tr><tr><td>Microbilancia automatizzata MX5</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubi da 1,6 ml rivestiti in silicio</td><td>Denville Scientific</td><td>C19033 o C19035</td><td></td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-esafluoro-2-propanolo (HFIP)</td><td>TCI America</td><td>H0424</td><td>Utilizzare in una cappa chimica.</td></tr><tr><td>Peroxidisolfato di ammonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-7460</td><td>Vortexare fino a quando la soluzione non diventa limpida. Il APS viene preparato fresco ogni volta e deve essere utilizzato entro 48 h.</td></tr><tr><td>Tris(2,2-bipiridil)diclororutenio(II) esaidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>224758-1G</td><td>Vortexare fino a quando la soluzione non diventa limpida. Coprire il tubo di RuBpy con della stagnola per proteggere il reagente dalla luce ambiente. Il RuBpy viene preparato fresco ogni volta e deve essere utilizzato entro 48 h.</td></tr><tr><td>Ditiotreitolo (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>D-Salt&amp;#8482; Esceclosio&amp;#8482; colonne di desalazione</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>20449</td><td></td></tr><tr><td>acetato di ammonio</td><td>Fisher Scientific</td><td>A637-500</td><td></td></tr><tr><td>Tubi da 0,6 ml rivestiti in silicone</td><td>Denville Scientific</td><td>C19063</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tricine Gel (10&amp;#8211;20%)</td><td>Invitrogen</td><td>EC6625B0X</td><td>10 alveoli; formato mini (8 cm X 8 cm); 25 &amp;#x03BC;volume di caricamento l per pozzetto; intervallo di separazione da 5 kDa a 40 kDa</td></tr><tr><td>Cuvetta in quarzo</td><td>Hellma</td><td>105.250-QS</td><td></td></tr><tr><td>Beckman DU 640 spettrofotometro</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>libreria di DNA a filamento singolo</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Personalizzato su ordinazione</td><td>La libreria è stata progettata per contenere 49 nucleotidi casuali delimitati da due regioni costanti che includono siti di legame per primer e siti di clonaggio: 5&amp;rsquo;-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C (N:25:25:25:25%) (N)&lt;sub&gt;49&lt;/sub&gt; G TCC GTT CGG GAT CCT C-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Taq DNA polimerasi</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>71160</td><td>Ricombinante &lt;em&gt;Thermus aquaticus&lt;/em&gt; DNA polimerasi fornita con 10&amp;#215; Buffer PCR e un tubo separato di MgCl₂ 25 mM&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; per PCR di routine.</td></tr><tr><td>Miscela di nucleotidi per PCR, soluzione 10 mM</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>77212</td><td>(10 mM ciascuno di dATP, dCTP, dGTP, dTTP)</td></tr><tr><td>Primer diretto</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Su richiesta</td><td>5&amp;rsquo;-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Primer inverso</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Su ordinazione personalizzata</td><td>5&amp;rsquo;-GAG GAT CCC GAA CGG AC-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Termostato cycler</td><td>Denville Scientific</td><td>Techne TC-312</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Denville Scientific</td><td>CA3510-8</td><td></td></tr><tr><td>Tubi conici sterili da 1,6 ml con tappi provvisti di guarnizioni ad anello</td><td>Denville Scientific</td><td>C19040-S</td><td></td></tr><tr><td>RiboMAX&amp;#8482; Sistema per la produzione su larga scala di RNA&amp;#8211;T7</td><td>Promega Corp.</td><td>P1300</td><td>Il kit contiene: 120 &amp;#x03BC;l'enzima mix (RNA polimerasi, RNasin ricombinante)&amp;#174; inibitore della ribonucleasi e pirofosfatasi inorganica ricombinante); 240 &amp;#x03BC;tampone di trascrizione 5; 100 &amp;#x03BC;l ciascuno dei 4 rNTP, 100 mM; 110 U di DNasi RQ1 priva di RNasi, 1 U/&amp;#x03BC;l; 10 &amp;#x03BC;DNA di controllo lineare, 1 mg/ml; 1 ml di acetato di sodio 3 M (pH 5,2); 1,25 ml di acqua priva di nucleasi</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P-citidina 5&amp;rsquo;-trifosfato, 250 &amp;mu;Ci (9,25 MBq) </td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>BLU008H250UC</td><td>Attività specifica: 3000 Ci (111 TBq)/mmol, 50 mM Tricina (pH 7,6)</td></tr><tr><td>Fenolo satura­to con citrato:cloroformio:alcol isoamilico (125:24:1, pH 4,7)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77619</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio:alcol isoamilo (24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo assoluto per biologia molecolare</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga refrigerata Z216-MK</td><td>Denville Scientific</td><td>C0216-MK</td><td></td></tr><tr><td>illustra ProbeQuant&amp;#8482; Colonne micro G-50</td><td>GE Healthcare</td><td>Ottenuto da Fisher Scientific (45-001-487)</td><td>Predisposto con Sephadex&amp;#8482; G-50 di grado DNA e pre-equilibrato in tampone STE contenente 0,15% di Kathon come biocida</td></tr><tr><td>Contatore a scintillazione da banco Triathler</td><td>Hidex Oy, Turku, Finlandia</td><td>Modello Triathler LSC: 425-034</td><td></td></tr><tr><td>Novex&amp;#174; TBE-Urea Buffer per Campioni (2&amp;#215;)</td><td>Invitrogen</td><td>LC6876</td><td></td></tr><tr><td>Gel al 6% TBE-urea, 1,0 mm, 10 pozzetti</td><td>Invitrogen</td><td>EC6865BOX</td><td></td></tr><tr><td>Novex&amp;#174; TBE Running Buffer (5&amp;#215;)</td><td>Invitrogen</td><td>LC6675</td><td></td></tr><tr><td>Decontaminante per radioattività</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-67</td><td></td></tr><tr><td>Punte per caricamento su gel</td><td>Denville Scientific</td><td>P3080</td><td></td></tr><tr><td>XCell &lt;em&gt;SureLock&lt;/em&gt; Mini-cellula</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td>XCell &lt;em&gt;SureLock&lt;/em&gt; Mini-cellula</td></tr><tr><td>Pellicola per autoradiografia</td><td>Denville Scientific</td><td>E3018</td><td>Utilizzare al buio completo</td></tr><tr><td>Pellicola per autoradiografia, Hyperfilm&amp;#8482; ECL</td><td>Amersham</td><td>RPN3114K</td><td>Può essere utilizzato sotto luce rossa di sicurezza.</td></tr><tr><td>Dischi di membrana</td><td>EMD Millipore</td><td>GSWP02500</td><td>Esteri misti di cellulosa, idrofili, 0,22-&amp;#x03BC;membrane dei dischi m</td></tr><tr><td>Base di supporto in vetro fritto per flacone da 125 ml</td><td>VWR international</td><td>26316-696</td><td></td></tr><tr><td>Pietre di Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-11YZ</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC32738-0050</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>118430010</td><td></td></tr><tr><td>Glicogeno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1767</td><td></td></tr><tr><td>2-propanolo per biologia molecolare</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore ricombinante della RNasi</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>71571</td><td></td></tr><tr><td>ImProm-II&amp;#8482;Sistema di Trascrizione Inversa</td><td>Promega Corp.</td><td>A3802</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore ricombinante della RNasi</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>71571</td><td></td></tr><tr><td>RapidRun&amp;#8482; Colorante di Carico</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>77524</td><td></td></tr></tbody></table>

selezione di aptamers per β-amiloide proteina, l&#39;agente eziologico della malattia di alzheimer

Selection of Aptamers for Amyloid &beta;-Protein, the Causative Agent of Alzheimer&#39;s Disease

Malattia di Alzheimer (AD) è un progressista, età-dipendente, malattia neurodegenerativa con un corso insidioso che rende difficile la diagnosi presintomatica 1. DC diagnosi definitiva si ottiene solo post-mortem, stabilendo così presintomatica, diagnosi precoce di Alzheimer è cruciale per lo sviluppo e l&#39;amministrazione terapie efficaci 2,3. Proteina β-amiloide (Aβ) è fondamentale per la patogenesi dell&#39;Alzheimer. Solubile, le assemblee oligomeriche Aβ si ritiene di influenzare neurotossicità sottostante disfunzione sinaptica e perdita di neuroni in AD 4,5. Varie forme di Aβ solubile assemblee sono stati descritti, tuttavia, le loro interrelazioni e la pertinenza ad eziologia e la patogenesi dC sono complessi e non ben compreso 6. Specifici strumenti di riconoscimento molecolare può svelare i rapporti tra assemblee Aβ e facilitare l&#39;individuazione e caratterizzazione di queste assemblee nelle prime fasi del decorso della malattia prima che i sintomi emergere. Il riconoscimento molecolare si basa generalmente su anticorpi. Tuttavia, una classe alternativa di strumenti di riconoscimento molecolare, aptameri, offre importanti vantaggi rispetto agli anticorpi 7,8. Aptameri oligonucleotidi sono generate da in-vitro selezione: evoluzione sistematica dei ligandi di arricchimento esponenziale (SELEX) 9,10. SELEX è un processo iterativo che, simile a quello dell&#39;evoluzione darwiniana, permette la selezione, l&#39;amplificazione, l&#39;arricchimento, e la perpetuazione di una proprietà, ad esempio, avido, specifico, di legame (aptameri) o l&#39;attività catalitica (ribozimi e DNAzymes). Nonostante la comparsa di aptameri come strumenti nel campo della biotecnologia moderna e della medicina 11, sono stati sottoutilizzati nel campo amiloide. RNA pochi o aptameri ssDNA sono stati selezionati contro varie forme di proteine ​​prioniche (PrP) 12-16. Un aptamero RNA generati contro ricombinante PrP bovina ha dimostrato di riconoscere bovina PrP-β 17, una solubile, oligomerici, β-sheet ricco di variante conformazionale di full-length PrP che si forma fibrille amiloidi 18. Aptameri generati utilizzando forme monomeriche e molti dei β fibrillare sono stati trovati 2-microglobulina (β 2 m) per legare fibrille di alcune altre proteine ​​amiloidogenica β oltre 2 m fibrille 19. Ylera et al. descritto aptameri RNA selezionato contro immobilizzato monomerico Aβ40 20. Inaspettatamente, queste aptameri legato fibrillare Aβ40. Complessivamente, questi dati sollevano diverse questioni importanti. Perché aptameri selezionati contro proteine ​​monomeriche riconoscere loro forme polimeriche? Potrebbe aptameri contro le forme monomerica e / o oligomerici di proteine ​​amiloidogenica ottenere? Per rispondere a queste domande, abbiamo cercato di selezionare aptameri per covalentemente stabilizzato oligomerici Aβ40 21 generati utilizzando foto-indotta cross-linking delle proteine ​​non modificato (PICUP) 22,23. Simile a risultati precedenti 17,19,20, questi aptameri reagito con fibrille di altre proteine ​​Aβ e diversi amiloidogenico probabilmente riconoscere un amiloide potenzialmente comuni strutturali aptatope 21. Qui, vi presentiamo la metodologia SELEX utilizzati nella produzione di questi aptameri 21.

Aptameri sono ribo-/deoxyribo-oligonucleotides corti selezionati<em&gt; In vitro</em&gt; Metodi evoluzione sulla base di affinità per un target specifico. Aptameri sono strumenti di riconoscimento molecolare con versatili applicazioni terapeutiche, diagnostiche e di ricerca. Dimostriamo metodi per la selezione di aptameri per la β-amiloide, proteina, l&#39;agente eziologico della malattia di Alzheimer.

Selezione di Aptamers per β-amiloide proteina, l&#39;agente eziologico della malattia di Alzheimer

La malattia di Alzheimer (AD) è un disturbo neurodegenerativo progressivo e correlato all'età, caratterizzato da un decorso insidioso che rende la sua diagnosi presintomatica...

L'obiettivo generale degli esperimenti di selezione è selezionare molecole di RNA che si legano in modo specifico e con alta affinità a una proteina bersaglio nell'RNA Selects. Ciò si ottiene mediante trascrizione in vitro di RNA da una libreria di oligonucleotidi di DNA randomizzati, seguita dall'incubazione del pool di RNA trascritto con la proteina bersaglio. Come secondo passaggio viene utilizzato un filtro di legame.Questo separa le molecole di RNA bersaglio leganti dal pool di RNA non legato. Successivamente, le molecole di RNA bersaglio leganti vengono eluite. Trascritte al contrario in DNA, amplificate mediante PCR e nuovamente trascritte in RNA.Questo pool di RNA, che ora è arricchito per alcuni aptameri leganti, viene utilizzato per il legame con la sequenza bersaglio nel ciclo successivo di selezione. Generalmente, dopo otto a venti cicli, vengono selezionati e caratterizzati aptameri specifici per la sequenza bersaglio con elevata avidità. Ciao, sono Gal Bean del Dipartimento di Neurologia presso l'UCLA oggi, Far Rahimi.Un postdottorato senior del mio laboratorio illustrerà un processo chiamato cellex. Abbiamo utilizzato questo processo in laboratorio per selezionare ab

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Abbiamo descritto una tecnica per la preparazione di omogenati chiarito umano corticale, la separazione delle proteine ​​mediante SDS-PAGE, recupero antigene e immunoblotting con un anticorpo per il peptide Aβ. Usando questo protocollo, abbiamo costantemente rilevare Aβ monomerici e multimerica nel tessuto corticale da esseri umani con patologia di Alzheimer.

Rilevazione SDS-PAGE/Immunoblot di multimeri Aβ in Human tessuto corticale omogenati utilizzando Antigen-epitopi recupero

Utilizzando la microscopia a forza atomica in combinazione con la tecnologia di biopanning abbiamo creato un sistema di biopanning negativo e positivo per acquisire anticorpi contro varianti proteiche specifiche per la malattia presenti in qualsiasi materiale biologico, anche a basse concentrazioni.  Siamo riusciti a ottenere anticorpi contro le varianti della proteina TDP-43 coinvolte nella sclerosi laterale amiotrofica.

Novel microscopia a forza atomica Based biopanning per isolamento di Morfologia reagenti specifici contro TDP-43 varianti di Sclerosi Laterale Amiotrofica

Mentre il trasporto delle proteine ​​di superficie cellulare è relativamente facile studiato, visualizzare il traffico di proteine ​​intracellulari è molto più difficile. Qui, usiamo costrutti incorporano GFP fotoattivabile e dimostrare un metodo per seguire con precisione la proteina precursore dell'amiloide dal Golgi di down-stream scomparti e seguire il suo gioco.

Imaging il traffico intracellulare di APP con GFP fotoattivabile

Per studiare gli effetti di Aβo in vivo, abbiamo sviluppato un modello basato su infusioni ippocampali ripetute di Aβo solubile accoppiate con infusione continua di anticorpi Aβo (6E10) nell'ippocampo utilizzando pompe osmotiche per contrastare l'effetto neurotossico di Aβo.

Neurodegenerazione in un modello animale di cronica amiloide-beta Oligomer infusione viene neutralizzata da anticorpi trattamento infuso con pompe osmotiche

Qui riportiamo un protocollo di purificazione HPLC su misura che produce peptidi di amiloide-beta 42 (Aβ42) e amiloide-beta 40 (Aβ40) ad alta purezza, in grado di formare oligomeri. L'amiloide-beta è un peptide idrofobico altamente incline all'aggregazione implicato nella malattia di Alzheimer. La natura amiloidogenica del peptide rende la sua purificazione una sfida.

Un Tailored HPLC purificazione protocollo che i rendimenti di elevata purezza beta-amiloide 42 e beta amiloide 40 peptidi, in grado di Oligomer Formazione

Un protocollo di frazionamento abbreviato per l'arricchimento di aggregati proteici di detersivo-insolubili dal cervello umano post mortem è descritto.

Arricchimento di aggregati proteici di detersivo-insolubili da cervello post mortem umano

Questo protocollo descrive come preparare oligomeri Aβ da un peptide sintetico in vitro e per valutare la quantità relativa di oligomero Aβ da un punto di analisi macchiante.

Oligomero di β-amiloide a11-positiva preparazione e valutazione utilizzando Dot Blotting analisi

Imaging molecolare con matrix-assisted laser desorbimento/ionizzazione-based imaging spettrometria di massa (MALDI-IMS) consente la mappatura simultanea di più analiti in campioni biologici. Qui, presentiamo un protocollo per la rilevazione e visualizzazione della proteina β amiloide sui tessuti di cervello del morbo di Alzheimer e campioni di angiopatia amiloide cerebrale usando MALDI-IMS.

Visualizzazione dei depositi β amiloide nel cervello umano con Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging spettrometria di massa

Il presente protocollo descrive e confronta la procedura per eseguire un'analisi a regione o sottoregione di interesse di sezioni cerebrali di topo sagittale per quantificare il carico di amiloide-beta nel modello murino transgenico APP / PS1 della malattia di Alzheimer.

Quantificazione completa rispetto a quella subregionale del carico di amiloide-beta sulle sezioni cerebrali del topo

Questo metodo di purificazione biochimica con analisi proteomica basata sulla spettrometria di massa facilita la robusta caratterizzazione dei nuclei di fibrille amiloidi, che possono accelerare l'identificazione di bersagli per la prevenzione della malattia di Alzheimer.

Purificazione biochimica e caratterizzazione proteomica dei nuclei di fibrille amiloidi dal cervello

Qui, descriviamo un sistema di lievito che ricostituisce la γ-secretasi umana. Questo sistema consente l'identificazione e lo studio delle mutazioni che influenzano l'attività e lo screening degli inibitori della γ-secretasi (GSI). Utilizzando le proprietà di perdita di funzione dei mutanti familiari della malattia di Alzheimer, è possibile eseguire lo screening per i modulatori della γ-secretasi (GSM).

Saccharomyces cerevisiae Modelli di malattia di Alzheimer per lo screening di geni, mutazioni e sostanze chimiche che influenzano la produzione di amiloide-beta da parte della γ-secretasi

Scopri la selezione di aptamer per la proteina β-amiloide legata alla malattia di Alzheimer. Questo metodo dimostra l'evoluzione in vitro di molecole RNA ad alta affinità per applicazioni diagnostiche e terapeutiche.

Selezione di Aptamers per β-amiloide proteina, l'agente eziologico della malattia di Alzheimer

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