Biomolecolare fluorescenza complementazione (BiFC) Assay per interazione proteina-proteina nelle cellule Cipolla Utilizzando la Helios Gun Gene

Questa procedura verifica l'interazione proteina-proteina in vivo tra due regolatori trascrizionali di Arabidopsis, SEU (spelling completo SEUSS) e LUH (LU HOG). Utilizzando la complementazione della fluorescenza biomolecolare, SEU viene fuso al frammento terminale N della proteina fluorescente gialla (YFP), mentre LUH viene fuso al frammento terminale C della YFP-DNA dei due costrutti plasmidici. I vettori SEUSS-NYFP e LUH-CYFP vengono bombardati in cellule epidermiche di cipolla per verificare la loro interazione.

Un'interazione tra Seuss e LUH provoca l'associazione dei frammenti terminale N e terminale C di YFP nei nuclei, portando alla fluorescenza di YFP nei nuclei. Dopo un'incubazione di 16-20 ore al buio, le squame epidermiche di cipolla vengono osservate al microscopio a fluorescenza per visualizzare la fluorescenza. Ciao, sono Courtney Hollander del laboratorio del Dott. Zhi Lu del Dipartimento di Biologia Cellulare e Genetica Molecolare dell'Università del Maryland.

Oggi vi mostreremo un procedimento per verificare l'interazione tra proteine in cellule di cipolla utilizzando la pistola genica BioRad Helios. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per analizzare le interazioni proteina-proteina e la localizzazione delle proteine nelle cellule vegetali. Cominciamo dunque.

Per iniziare questa procedura, preparare le cartucce per la pistola genica Helios seguendo il protocollo video di JoVE di Woods e Zeto 2008, che illustra in dettaglio la procedura di preparazione delle cartucce per ogni preparazione. 50 microgrammi di DNA plasmidico totale vengono mescolati con 12,5 milligrammi di particelle d'oro e soluzione di PVP 0,5 milligrammi per millilitro per BIFC. Combinando la stessa preparazione della cartuccia, i due DNA plasmidici delle proteine in interazione putative Seuss fuse alla metà N-terminale di YFP, abbreviato seus, NYFP e LU Homolog fuse alla metà C-terminale di YFP abbreviato L-U-H-C-Y-F-P.

La quantità totale è di 50 microgrammi per preparazione, producendo fino a 50 cartucce con un microgrammo di DNA per 0,25 milligrammi di oro per cartuccia. Ogni cartuccia è destinata a un singolo sparo. Dopo la preparazione delle cartucce, testarle per verificare se le particelle d'oro vengono espulse in modo efficiente.

Avvolgere un quadrato di parafilm attorno a una piastra di Petri. Impostare quindi la pressione dell'elio tra 150 e 200 PSI e sparare le cartucce appena preparate sul quadrato di parafilm. Osservare lievi particelle dorate sul parafilm.

Quantità diverse di particelle d'oro possono essere propulse sul parfum a diverse pressioni di elio. Tuttavia, se non c'è una differenza significativa, scegliere la pressione più bassa per il bombardamento. Questo test indica anche l'area coperta da ogni singolo colpo.

Per preparare i tessuti di cipolla, rimuovere la buccia esterna da una cipolla gialla grande utilizzando una lametta pulita e affilata. Tagliare un'area rettangolare di due per otto centimetri, profonda quattro o cinque strati. Estrarre il tessuto rettangolare di cipolla e scartare i due strati esterni.

Tagliare i restanti strati della cipolla in pezzi quadrati di circa 1,5 centimetri. Collocare i pezzi di cipolla in una piastra di Petri contenente cerchi di carta filtrante da tre mm. Inumidire con acqua sterile e coprire la piastra di Petri.

I pezzi di cipolla sono pronti per il bombardamento. Inserire prima le cartucce nei supporti circolari bianchi per cartucce; caricare cartucce contenenti costrutti plasmidici diversi in supporti separati. Ogni supporto può contenere fino a 12 cartucce, corrispondenti a 12 spari.

Vengono caricati qui tre diversi portapiastrine. Il primo portapiastrina contiene cartucce con il promotore forte e costitutivo 35 S-G-F-P-A del virus del mosaico del cavolfiore. Questo plasmide funge da controllo positivo.

Il secondo supporto viene caricato con le cartucce sperimentali contenenti una quantità equimolare di S-E-U-N-Y-F-P e L-U-H-C-Y-F-P. Il terzo supporto per cartucce viene caricato con cartucce contenenti una miscela equimolare del vettore puck spine e LUH puck spice. Questa funge anche da controllo negativo.

Inserire la batteria e il nuovo rivestimento del cannello nel cannello genico Helios. Assicurarsi che sia il rivestimento del cannello sia il cannello siano dotati dei rispettivi anelli O-ring. Successivamente, inserire un portacartucce vuoto nel cannello genico, con il numero di marcatura 12 sul portacartucce rivolto verso la parte superiore del cannello.

Spostare il supporto del cartuccia una o due volte per assicurarsi che sia inserito correttamente. Quindi collegare la pistola alla bombola di elio e regolare la pressione tra 150 e 200 PS.I indossare protezioni per le orecchie e sparare alcune volte premendo il pulsante laterale mentre si tira il grilletto. Sparare con il supporto del cartuccia vuoto permette di pulire la camera della pistola e garantisce che la pressione sia stabile.

Prima di sparare il DNA, sparare un pezzo di cipolla qui può fungere da controllo negativo per la fluorescenza di fondo. Per sparare le particelle d'oro rivestite di DNA, rimuovere il supporto del cartuccia vuoto e inserire il primo supporto del cartuccia caricato contenente il controllo positivo. Avanzare il supporto del cartuccia in modo che il cartuccia destinato allo sparo sia posizionato nella parte inferiore del supporto.

Ora posizionare i pezzi di cipolla al centro di una piastra di Petri vuota, con lo strato più interno della cipolla rivolto verso l'alto. Appoggiare il manicotto del gene gun sulla piastra di Petri e sparare con l'apparecchio. Passare alla cartuccia successiva e sparare su un pezzo diverso di cipolla.

Ripetere questo passaggio fino a quando non sono stati sparati quattro o cinque pezzi di cipolla. Ogni pezzo di cipolla viene sparato una sola volta dopo lo sparo. Trasferire il pezzo di cipolla bombardato in una piastra di Petri contenente carta filtrante da tre mm umida per sparare le cartucce sperimentali.

Passare alla cartuccia Holden. Numero due, ricordarsi di sostituire il rivestimento della canna per prevenire contaminazioni. Sparare quattro o cinque pezzi di cipolla come appena mostrato per il controllo positivo.

Quindi passare alla cartuccia Holden numero tre, contenente il DNA di controllo negativo. E nuovamente, sparare quattro o cinque pezzi di cipolla.

Cambiare il rivestimento del barile per prevenire contaminazioni. Dopo il bombardamento, coprire le piastre di Petri contenenti i pezzi di cipolla con i coperchi.

Avvolgerli con paraform per prevenire l'essiccazione. Incubare i pezzi di cipolla a temperatura ambiente al buio per 16-48 ore. Una volta terminata la bombardamento, spegnere il gas e rilasciare la pressione prima di staccare la pistola genica dalla bombola di elio, svitare il rivestimento della canna ed estrarre il supporto del cartuccia e le cartucce usate.

Infine, pulire i supporti delle cartucce e i rivestimenti della canna immergendoli in un becher contenente acqua saponata e sottoporli a sonificazione per 20 minuti. Successivamente, risciacquare con acqua per rimuovere tutti i residui di sapone.

Immergere nell'etanolo al 70% per un'ora, quindi asciugare su carta da filtro. Procedere con l'osservazione dei pezzi di cipolla da 16 a 20 ore dopo il bombardamento. Dopo aver incubato i pezzi di cipolla bombardati da 16 a 20 ore a temperatura ambiente, utilizzare pinzette con estremità piatte per rimuovere lentamente uno strato cellulare singolo dall'epidermide interna della cipolla.

Questo è lo strato che durante il bombardamento è direttamente esposto alla pistola. Posizionare lo strato pelato su una goccia d'acqua su un vetrino con un coprioggetto. Tuttavia, fare attenzione a minimizzare le bolle d'aria.

Osservare la fluorescenza di GFP o YFP utilizzando un microscopio a fluorescenza come lo zes axio observer, punto Z uno mostrato qui sotto in campo chiaro al microscopio. Verificare innanzitutto la presenza di flusso citoplasmatico per assicurarsi che le cellule siano vive. Per fare ciò.

Esponi il vetrino alla luce del campo chiaro per alcuni minuti per riscaldare il tessuto di cipolla e quindi cerca il movimento del citoplasma. Il flusso citoplasmatico non è sempre facile da osservare, quindi non scoraggiarti se non è chiaramente visibile. Per la rilevazione in fluorescenza, utilizza filtri di eccitazione e di rilevamento appropriati per GFP o YFP. Controlla anche i controlli negativi, costituiti da pezzi di cipolla trasfettati con un plasmide non fluorescente.

Possono apparire deboli segnali gialli da cellule danneggiate, detriti e cipolle. Inoltre, verificare i controlli positivi. Il plasmide contenente il reporter fluorescente espresso costitutivamente.

La fluorescenza GFP è visibile in alcune ma non in tutte le cellule. Anche le bolle d'aria possono produrre fluorescenza di fondo. I segnali GFP visibili nelle cellule epidermiche della cipolla indicano che le cartucce, i tessuti di cipolla e lo sparo del gene gun sono stati correttamente preparati ed eseguiti.

Qui è mostrata la forte fluorescenza osservata dal plasmide positivo per SGFP 35. La forte fluorescenza è visibile in tutta la cellula, inclusi sia il nucleo che il citoplasma. L'immagine in campo chiaro permette di vedere il contorno corrispondente delle cellule e dei nuclei.

Non tutte le cellule vengono trasformate. Il segnale fluorescente di YFP viene rilevato nel nucleo delle cellule di cipolla quando la combinazione sperimentale Seuss, NYFP e L-U-H-C-Y-F-P viene bombardata nelle cellule di cipolla, indicando che Seuss, NYFP e L-U-H-C-Y-F-P interagiscono in vivo. Tuttavia, questa fluorescenza mediata dall'interazione è significativamente più debole rispetto alla fluorescenza mediata da 35 SGFP nel controllo positivo.

Inoltre, i fattori di trascrizione SEUS e LUH sono localizzati nei nuclei. Pertanto, la fluorescenza YFP è osservata solo nel nucleo. Inoltre, il numero di cellule fluorescenti è significativamente inferiore rispetto a quello del controllo positivo 35 SGFP.

Ciò è dovuto al fatto che la B FFC funziona solo quando entrambi i plasmidi partner vengono espressi nelle stesse cellule di cipolla. Nessun segnale fluorescente viene rilevato nelle cipolle bombardate con il portacartucce numero tre, contenente una miscela di puck spine, vettore e L-U-H-C-Y-F-P, come previsto per il controllo negativo. Vi abbiamo appena mostrato come bombardare cellule di cipolla per verificare interazioni proteina-proteina utilizzando il sistema di gene gun BioRad Helios.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di utilizzare appropriati controlli positivi e negativi e di tenere presente che il segnale di fluorescenza BIFC potrebbe essere più debole e il numero di cellule fluorescenti inferiore. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.