Biomolecolare fluorescenza complementazione (BiFC) Assay per interazione proteina-proteina nelle cellule Cipolla Utilizzando la Helios Gun Gene

Questa procedura testa in vivo l'interazione proteina proteina tra due regolatori di trascrizione di Arabidopsis, seus scritto SEU, in breve e lu holog o LUH. Utilizzando la fluorescenza biomolecolare, il seus viene fuso al frammento terminale terminale di una proteina fluorescente gialla, o YFP e LUH viene fuso al frammento terminale C di Y-F-P-D-N-A dei due costrutti plasmidici. Seuss, NYFP e L-U-H-C-Y-F-P vengono bombardati nelle cellule epidermiche della cipolla per testare la loro interazione.

Un'interazione tra Seuss e LUH determina l'associazione dei frammenti terminale terminale e C terminale di YFP nei nuclei, portando alla fluorescenza YFP nei nuclei. Dopo un'incubazione di 16-20 ore al buio, le bucce epidermiche della cipolla vengono osservate al microscopio a fluorescenza per visualizzare la fluorescenza. Ciao, sono Courtney Hollander del laboratorio del Dr.Zhi Lu presso il Dipartimento di Biologia Cellulare e Genetica Molecolare dell'Università del Maryland.

Oggi vi mostreremo una procedura per testare l'interazione proteina-proteina nelle cellule di cipolla utilizzando la pistola genetica BioRad Helios. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per testare le interazioni proteina-proteina e la localizzazione delle proteine nelle cellule vegetali. Quindi iniziamo.

Per iniziare questa procedura, preparare le cartucce per la pistola genetica Helios seguendo il Joe Video Protocol di Woods e Zeto 2008 che dimostra in dettaglio la procedura di preparazione della cartuccia per ogni preparazione di cartucce. 50 microgrammi di DNA plasmatico totale vengono miscelati con 12,5 milligrammi di particelle d'oro e 0,5 milligrammi per millilitro di soluzione PVP per BIFC. Combinando la stessa preparazione della cartuccia, i due DNA plasmatici delle proteine interagenti putative Seuss si sono fusi alla metà N terminale di YFP, abbreviato seus, NYFP e LU Homolog fuso alla metà C terminale di YFP abbreviato L-U-H-C-Y-F-P.

La quantità combinata è di 50 microgrammi per preparazione, producendo fino a 50 cartucce con un microgrammo di DNA per 0,25 milligrammi di oro per cartuccia. Ogni cartuccia è per un colpo. Dopo la preparazione della cartuccia, testare le cartucce per verificare se le particelle d'oro vengono spinte in modo efficiente.

Avvolgi un pezzo quadrato di paraforma attorno a una capsula di Petri. Quindi impostare la pressione dell'elio tra 150 e 200 PSI e sparare le cartucce appena realizzate nel quadrato del param. Osservare deboli particelle d'oro sul profumo.

Diverse quantità di particelle d'oro possono essere spinte sul profumo a diverse pressioni dell'elio. Tuttavia, se non c'è una differenza significativa, scegliere la pressione più bassa per il bombardamento. Questo test indica anche l'area coperta da ogni ripresa.

Per preparare i fazzoletti di cipolla, staccare la pelle esterna da una grande cipolla gialla usando una lama di rasoio pulita e affilata. Taglia un'area rettangolare di due x otto centimetri, profonda quattro o cinque strati. Togliete il fazzoletto di cipolla rettangolare e scartate i due strati esterni.

Tagliate gli strati rimanenti della cipolla in pezzi quadrati di circa 1,5 centimetri. Mettere i pezzi di cipolla in una capsula di Petri contenente cerchi di carta da filtro da tre mm. Inumidita con acqua sterile, coprire la capsula di Petri.

I pezzi di cipolla sono pronti per il bombardamento. Per prima cosa Caricare le cartucce nei portacartucce rotondi bianchi Caricare le cartucce contenenti diversi costrutti plasmidici in diversi supporti per cartucce. Ogni portacartuccia può contenere fino a 12 cartucce per 12 colpi.

Qui vengono caricati tre diversi supporti. Il primo supporto ha cartucce contenenti 35 S-G-F-P-A promotore forte e costitutivo del virus del mosaico del cavolfiore. Questo plasmide funge da controllo positivo.

Il secondo supporto è caricato con le cartucce sperimentali contenenti una quantità uguale di S-E-U-N-Y-F-P e L-U-H-C-Y-F-P. Il terzo portacartucce è caricato con cartucce contenenti un mix molare uguale del vettore della spina dorsale del disco e della spezia del disco LUH. Questo serve anche come controllo negativo.

Inserisci la batteria e il rivestimento della canna fresco nella pistola genetica Helios. Assicurarsi che sia la canna che la pistola abbiano i rispettivi O-ring attaccati. Quindi, inserire un portacartuccia vuoto nella pistola genetica con il numero di tacca 12 sul portacartuccia rivolto verso la parte superiore della pistola.

Far avanzare il supporto della cartuccia una o due volte per assicurarsi che sia inserito correttamente. Quindi collegare la pistola al serbatoio dell'elio e regolare la pressione tra 150 e 200 CV. Indosso protezioni per le orecchie e sparo con la pistola un paio di volte tenendo premuto il pulsante laterale mentre premo il grilletto. Sparando con il portacartuccia vuoto, caricato, si pulisce la camera della pistola e si garantisce che la pressione sia stabile.

Prima di sparare al DNA, sparare un pezzo di cipolla qui può essere un controllo negativo per la fluorescenza di fondo. Per sparare le particelle d'oro rivestite di DNA, rimuovere il portacartuccia vuoto e inserire il primo portacartuccia caricato contenente il controllo positivo. Far avanzare il supporto della cartuccia in modo che la cartuccia destinata allo sparo sia posizionata nella parte inferiore del supporto della cartuccia.

Ora metti i pezzi di cipolla al centro di una capsula di Petri vuota con lo strato più interno della cipolla rivolto verso l'alto. Appoggia il rivestimento della canna della pistola genetica sulla capsula di Petri e spara con la pistola. Passa alla cartuccia successiva e spara a un altro pezzo di cipolla.

Ripeti questo passaggio fino a quando non vengono sparati quattro o cinque pezzi di cipolla. Ogni pezzo di cipolla viene sparato una sola volta dopo aver sparato. Trasferire il pezzo di cipolla bombardato in una capsula di Petri contenente carta da filtro umida da tre mm per sparare le cartucce sperimentali.

Passa alla cartuccia Holden. Numero due, ricordarsi di cambiare il rivestimento della canna per evitare contaminazioni. Spara da quattro a cinque pezzi di cipolla come appena mostrato per il controllo positivo.

Quindi passare alla cartuccia Holden. Numero tre, contenente il DNA di controllo negativo. E ancora, spara da quattro a cinque pezzi di cipolla.

Sostituire il rivestimento della canna per evitare contaminazioni. Dopo il bombardamento. Coprite le piastre di Petri contenenti i pezzi di cipolla con i coperchi.

Avvolgerli con paraforma per evitare che si secchino. Incubare i pezzi di cipolla a temperatura ambiente al buio per 16-48 ore. Una volta terminato il bombardamento, spegnere il gas e rilasciare la pressione prima di staccare la pistola genetica dal serbatoio dell'elio, svitare il rivestimento della canna e rimuovere il supporto della cartuccia e le cartucce usate.

Infine, pulire i supporti della cartuccia e le fodere della canna immergendoli in un becher con acqua saponata e sonicare. Per 20 minuti. Successivamente, risciacquare con acqua per rimuovere tutti i residui di sapone.

Immergere in etanolo al 70% per un'ora e poi asciugare su carta assorbente. Procedere all'osservazione dei pezzi di cipolla da 16 a 20 ore dopo il bombardamento. Dopo aver incubato i pezzi di cipolla bombardati per 16-20 ore a temperatura ambiente, usa una pinza con le estremità piatte per staccare lentamente un singolo strato cellulare dall'epidermide interna della cipolla.

Questo è lo strato che si affaccia direttamente sul cannone durante il bombardamento. Posizionare lo strato sbucciato su una goccia d'acqua su un coperchio per vetrini con un vetrino coprioggetti. Ma fai attenzione a ridurre al minimo le bolle.

Osservare la fluorescenza GFP o YFP utilizzando un microscopio a fluorescenza come l'osservatore zes axio, punto Z mostrato qui sotto il campo luminoso del microscopio. Per prima cosa controlla il flusso citoplasmatico per assicurarti che le cellule siano vive. Per farlo.

Esporre il vetrino alla luce del campo chiaro per alcuni minuti per riscaldare il tessuto della cipolla e poi cercare plastiche in movimento Lo streaming citoplasmatico non è sempre facile da vedere, quindi non scoraggiatevi se non è chiaramente visibile. Per la rilevazione della fluorescenza, utilizzare filtri di eccitazione e rilevamento appropriati per GFP o YFP. Controllate anche i controlli negativi, che sono i pezzi di cipolla sparati con un plasmide non fluorescente.

Deboli segnali gialli possono apparire da cellule ferite e detriti e cipolle. Inoltre, controlla i controlli positivi. Il plasmide contenente reporter fluorescente espresso costitutivamente.

La fluorescenza GFP si osserva in alcune cellule, ma non in tutte. Le bolle d'aria possono anche produrre fluorescenza di fondo. I segnali visibili di GFP dalle cellule epidermiche di cipolla indicano che le cartucce, i tessuti di cipolla e l'attivazione della pistola genica sono adeguatamente preparati ed eseguiti.

Qui è mostrata la forte fluorescenza osservata dal plasmide positivo 35 SGFP. La forte fluorescenza si osserva in tutta la cellula, compreso il nucleo e il citoplasma. L'immagine in campo chiaro permette di vedere il contorno corrispondente delle cellule e dei nuclei.

Non tutte le cellule vengono trasformate. Il segnale fluorescente YFP viene rilevato nel nucleo della cellula di cipolla quando la combinazione sperimentale Seuss, NYFP e L-U-H-C-Y-F-P viene bombardata in cellule di cipolla, indicando che Seuss NYFP e L-U-H-C-Y-F-P interagiscono in vivo. Tuttavia, questa fluorescenza mediata dall'interazione è significativamente più debole della fluorescenza mediata da 35 SGFP nel controllo positivo.

Inoltre, i fattori di trascrizione SEUS e LUH sono localizzati nei nuclei. Pertanto, la fluorescenza YFP si osserva solo nel nucleo. Inoltre, il numero di celle fluorescenti è significativamente inferiore a quello del controllo positivo 35 SGFP.

Questo perché la FFC B funziona solo quando entrambi i plasmidi partner sono espressi nelle stesse cellule di cipolla. Nessun segnale fluorescente viene rilevato nelle cipolle, bombardate con il supporto della cartuccia numero tre contenente un mix di spina del disco, vettore e L-U-H-C-Y-F-P Come ci si aspetta dal controllo negativo. Vi abbiamo appena mostrato come bombardare le cellule di cipolla per testare le interazioni proteiche utilizzando il sistema di pistola genica BioRad Helios.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di utilizzare controlli positivi e negativi adeguati e di sapere che la fluorescenza BIFC può essere più debole nel segnale e meno nel numero di celle fluorescenti. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.