Name: Derivazione di cellule staminali trofoblasto mouse da blastocisti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-08T17:03:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Impara a derivare cellule staminali trofoblasto da blastocisti murine per studiare la biologia del trofoblasto e lo sviluppo placentare. Questo metodo permette di mantenere le proprietà staminali e indurre la differenziazione in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori ringraziano Janet Rossant per il protocollo originale. Questo studio è stato sostenuto dal National Institute of Health concedere CA106308 a WH.

In questo protocollo, si descrive la preparazione di blastocisti mouse e la creazione di linee cellulari TS. Manipolazioni del mouse generale prima della raccolta di blastocisti, tra cui il set-up per la monta naturale e l'induzione dell'ovulazione super, in fondo, il protocollo standard illustrato da Nagy et al. 2003 (pp146-150). Derivazione e il mantenimento delle cellule TS <ol><li> Setup croce riproduzione tra i topi di interesse. </li><li> Preparare fibroblasti embrionali di topo (MEF) come cellule nutrici. Due giorni prima della raccolta delle blastocisti, MEF (2 x 10 6 cellule) sono placcati in 100 piatti mm. Il giorno dopo, queste cellule vengono trattate con 10 ml di terreno TS contenente mitomicina C (20 mg / ml) per un 2 ore di incubazione a 37 ° C, 5% di CO 2. Questo è seguito da lavaggio delle cellule due volte con PBS. Le cellule C mitomicina trattate vengono poi seminate a 12-pozzetti (1 x 10 5 cellule / pozzetto). </li><li> Il giorno della raccolta blastocisti (3,5 DPC, indicato come primo giorno), terreno di coltura è sostituito dal MEF TS medio più 1x FGF4/Heparin (0,5 ml / pozzetto). </li><li> Preparazione per la raccolta dell 'utero: eutanasia con il mouse e individuare l'utero (Figura 1A). </li><li> Togliere l'utero afferrandolo con una pinza al collo dell'utero (che si trova dietro la vescica) e tagliare attraverso la giunzione dell'utero e della cervice uterina (Figura 1B). Tirare l'utero, tagliare la membrana e nei tessuti grassi e tagliare via l'utero sotto l'incrocio con la ovidotto (Figura 1C). Luogo cervice (Figura 1D) in un piccolo volume (0,2 ml) di media TS in un piatto di 60 mm. </li><li> Invia ogni corno dell'utero con 1 ml di terreno TS utilizzando una siringa da 1 ml con una 26-gauge. Inserire l'ago nella base di utero e sciacquare lentamente in un nuovo 60 mm con 1 media TS ml. L'utero deve essere gonfiato ed esteso completamente durante il lavaggio. </li><li> Raccogliere e trasferire la blastocisti con cura in un ambiente pulito 12 pozzetti contenenti medio TS con una bocca controllato pipetta. Lavare blastocisti tre volte trasferimento seriale attraverso media TS a 12-pozzetti. Mettere una blastocisti per bene (Figura 2A) in un 12-pozzetti contenenti la mitomicina C trattati con alimentatori MEF e della cultura a 37 ° C, 5% di CO 2. </li><li> La blastocisti si schiuderanno dalla zona pellucida e allegare ai pozzetti in 24 a 36 ore. Una piccola escrescenza sarà prontamente osservato il giorno 3. Alimentare le culture con 500 microlitri TS medio fresco più 1x FGF4/Heparin. </li><li> Il giorno 4 o 5, la conseguenza blastocisti dovrebbe essere pronto per la disaggregazione a seconda della sua grandezza. La dimensione ideale per la disaggregazione delle cellule TS è illustrato in Figura 3B. Lavare le culture una volta con 0,5 ml di PBS. Aggiungere 100 ml 0,25% tripsina / EDTA e incubare per 5 minuti a 37 ° C, 5% di CO 2. Rompere il escrescenza in piccoli grumi pipettando su e giù vigorosamente con un pipetteman P100. Fermare il tripsinizzazione aggiungendo TS-70cm-1.5F4H (medio TS 30%, 70% MEF-CM più FGF4/Heparin 1.5x) nel pozzo. Cambia media 8 ore dopo la disaggregazione e continuare ad alimentare le cellule ogni 2 giorni. </li><li> Tra i giorni 6 e 10 (molto variabile) colonie di cellule TS può essere osservato. Hanno una lastra piana e come morfologia epiteliale con un confine chiaro colonia (Figura 2C). Continuano ad alimentare le culture ogni 2 giorni </li><li> Quando le cellule TS raggiungere il 50% confluenza (di solito tra i giorni 15 e 20), lavare una volta con PBS e aggiungere 100 ml 0,25% tripsina / EDTA. Pipetta su e giù durante tripsinizzazione per garantire un vicino cella singola sospensione. Fermare il tripsinizzazione aggiungendo TS-70cm-1.5F4H e trasferimento in nuovi piatti da 6 o 60 millimetri e contiene il mitomicina C trattati con alimentatori MEF (2,5 x 10 5 cells/6-well o 5 x10 5 cells/60mm piastra). </li><li> Cambia media 8 ore dopo il passaggio e continuare ad alimentare le culture ogni 2 giorni. </li><li> Dopo uno o due in più passaggi (3-5 giorni tra i passaggi) sul alimentatori MEF, le cellule possono essere coltivate TS senza di loro. Perché MEF allegare alla piastra di coltura molto più veloce rispetto alle cellule TS dopo tripsinizzazione, tale differenza nel tasso aderente può essere utilizzata per separare le cellule TS dal alimentatori MEF. Dopo aver superato le cellule in coltura, li incubare a 37 ° C, 5% di CO 2 per 30 min. La maggior parte MEF attribuirà alla piastra e la popolazione TS rimane in sospensione. Trasferire il supernatante in una nuova piastra. Ripetere questo processo per vari passaggi per ottenere una popolazione pura TS. </li><li> Mantenere le cellule TS a TS-70cm-1.5F4H e passarli ogni 4 giorni (1:10-1:20 split) o ​​quando la cultura raggiunge il 70% confluenza. Passando le cellule con alta densità (superiore a dividere 1:5) o coltura quando eccessivamente confluenti può causare la loro differenziazione. </li><li> L'identità delle cellule TS può essere confermata mediante immunocolorazione di un marker delle cellule, Cdx2 (Figura 3). </li></ol> Celle di congelamento TS <ol><li> Preparare 2x medio congelamento (50% FBS, 30 di media TS% e 20% DMSO). </li><li> Cocellule TS llect da tripsinizzazione, seguita da centrifugazione a 450g per 6 min. Risospendere in media TS con volume equivalente di mezzo di congelamento 2x. </li><li> Congelare le cellule lentamente utilizzando una camera di alcool isopropilico a -70 ° C ed il trasferimento di azoto liquido, dopo 24-48 ore. </li><li> Un piatto 60 mm (70% confluenti) è di solito tenuti in 2 flaconi. </li></ol> Scongelamento cellule TS <ol><li> Scongelare rapidamente il flacone a 37 ° C, raccoglierli in 10 ml mezzi TS mediante centrifugazione (450g, 6 min), e risospendere in 30% TS media, 70cm-1.5F4H. </li><li> Un flaconcino di cellule seminate in una piastra 60 mm. </li></ol> TS differenziazione cellulare in TGC Differenziazione delle cellule TS in cellule giganti trofoblasto (TGCs) può essere indotta dal ritiro del MEF-CM, FGF4 ed eparina. Il fenotipo TGC (nuclei di grandi dimensioni) possono essere individuati quattro giorni dopo l'induzione (Tanaka et al., 1998 e Chiu et al. 2008). Immunocolorazione p450scc di rilevare l'espressione di questo marcatore TGC nella cultura differenziata (Figura 4A). Citometria a flusso di PI (ioduro di propidio) cellule colorate dimostra ulteriormente la presenza di cellule differenziate con contenuto di DNA superiore (Figura 4B). Questi risultati suggeriscono che le cellule subiscono TS endoreduplicazione a diventare TGCs poliploidi. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Dissezione di uteri mouse. (A) Luogo della cervice è indicata dalle frecce. (B) Tagliare attraverso la giunzione dell'utero e della cervice uterina, come mostrato. (C) Tagliare l'utero appena sotto la ovidotto (OD) sotto l'ovaio (OV). (D) Immagine della cervice. <img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Immagini figura rappresentativa 2. Illustrare blastocisti del mouse, escrescenza blastocisti e colonia trofoblasto. (A) Un topo blastocisti raccolti E3.5 viene mostrato. ICM, la massa cellulare interna, MT, trophectoderm murale, PT, trophectoderm polare. (B) Un escrescenza trofoblasto su linee MEF è mostrato. TS, di cellule staminali trofoblasto. (C) Una colonia trofoblasto cellule staminali mostra un chiaro vantaggio su linee MEF. Le frecce indicano il confine della cella. <img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Identificazione di cellule TS immunocolorazione analisi. TS (AD) ed ES (controllo, EH) le cellule sono sottoposte a identificazione marcatore. Le cellule sono immunoistochimica con anticorpi per riconoscere Oct4 (A, E) o Cdx2 (B, F), e di contrasto con DAPI (C, G) ha presentato nelle immagini fuse (D, H). Scala bar, 50 micron. <img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Differenziazione delle cellule TS in vitro. (A) Indifferenziato (Undiff) o differenziato (Diff), le cellule in coltura sono stati esaminati per l'espressione di un marker TGC, p450scc (verde), di contrasto con DAPI (rosso). (B) L'analisi citofluorimetrica delle cellule differenziate, colorate con PI, misura il contenuto del DNA (M1, da due a quattro copie, M2, più di quattro copie). La popolazione M2 rappresenta il trofoblasto cellule poliploidi.

<ol><li>Chiu, S. Y., Asai, N., Costantini, F. &amp, Hsu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO-specific+protease+2+is+essential+for+modulating+p53-Mdm2+in+development+of+trophoblast+stem+cell+niches+and+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">SUMO-specific protease 2 is essential for modulating p53-Mdm2 in development of trophoblast stem cell niches and lineages.</a> PLoS Biol. 6, E310-E310 (2008).</li>
<li>Kunath, T., Arnaud, D., Uy, D. G., Okamoto, I., Chureau, C., Yamanaka, Y., Heard, E., Gardner, R. L., Avner, P., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imprinted+X-inactivation+in+extra-embryonic+endoderm+cell+lines+from+mouse+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Imprinted X-inactivation in extra-embryonic endoderm cell lines from mouse blastocysts.</a> Development. 132, 1649-1661 (2005).</li>
<li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+The+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: The Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2003).</li>
<li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+FGF4%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4.</a> Science. 282, 2072-2075 (1998).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In questo video, dimostriamo il processo per la raccolta E3.5 blastocisti dalle procedure di uteri e sperimentali per stabilire linee di cellule TS. Abbiamo anche descrivere la condizione per mantenere la staminalità delle cellule TS e per indurre la loro differenziazione in cellule differenziate. A due passi fondamentali per ottenere linee cellulari puro TS sono i tempi per la disaggregazione escrescenza (punto 9) e la lavorazione del primo passaggio (passo 11). E &#39;stato riportato che endoderma primitivo cellule de...

Reagenti TS medio: RPMI-1640, FBS 20%, 1 piruvato di sodio mm, 100 mm beta-mercaptoetanolo e 100 mg / ml di penicillina-streptomicina. Mitomicina C: Sciogliere 2 mg di mitomicina C (Sigma M-0503) in 2 ml di PBS e aggiungere questa miscela 2 ml in 200 ml di mezzo di TS (10 ng / ml). Fare 20 aliquote (10 ml) e conservare a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. Aggiungere una aliquota per 100 piastra mm. Fibroblasti embrionali di topo-condizione medio (MEF-CM): Piastra MEF in 100 piastre mm (1 x 10 6 / piastra). Il giorno dopo, aggiungere 10 ml di medie TS per ogni piatto e continuare con la cultura per 48 ore. Raccogliere il terreno di coltura, filtrarli (0,45 mm) e conservare a -20 ° C in 35 aliquote da ml. Disgelo ciascuna aliquota quando necessario, che può essere conservato a 4 ° C. Il MEF può essere utilizzato per preparare due lotti più di CM prima che diventino confluenti. PBS / BSA: Sciogliere BSA, frazione V (Sigma A3311, 0,1% (w / v)) in PBS (10 ml), filtrare attraverso una siringa da 0,45 millimetri filtro e fare 1 aliquote ml in provette da 1,5 ml. Conservare a -70 ° C e scongelare un tubo quando necessario per prepararsi FGF4. FGF4 (1000x): Risospendere liofilizzato FGF4 (Sigma F8424, 25 mg) con 1 ml di PBS / BSA soluzione. Mescolare bene e fare 10 aliquote (100 ml) in provette da 1,5 ml e conservare a -70 ° C. Disgelo ogni tubo quando necessario e conservare le rimanenti a 4 ° C, non ricongelare. Diluire 1000 volte in media TS di ottenere 1x FGF4 (25 ng / ml). Eparina (1000x): Risospendere eparina (Sigma H3149, 10.000 unità) in PBS alla concentrazione finale di 1 mg / ml (1000x). Fai aliquote di 100 ml in provette da 1,5 ml e conservare a -70 ° C. Aliquote disgelo quando necessario e conservare le rimanenti a 4 ° C, non ricongelare. Diluire 1000 TS tempo medio per ottenere 1x eparina (1 ng / ml).

derivazione di cellule staminali trofoblasto mouse da blastocisti

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specificazione del trophectoderm è uno degli eventi più antichi differenziazione di sviluppo dei mammiferi. Il lignaggio trofoblasto deriva dalla impianto trophectoderm media e genera la parte fetale della placenta. Di conseguenza, lo sviluppo di questo lignaggio è essenziale per la sopravvivenza dell&#39;embrione. Derivazione di staminali trofoblasto (TS), le cellule da blastocisti mouse è stato descritto per primo da Tanaka<em&gt; Et al.</em&gt; 1998. La capacità delle cellule TS per preservare la proprietà specifica trofoblasto e la loro espressione di stage e cellule di tipo-specifici marcatori dopo la stimolazione adeguata fornisce un sistema valido modello per studiare lo sviluppo lignaggio trofoblasto cui ricapitolando eventi placentazione presto. Inoltre, le cellule trofoblasto sono uno dei pochi tipi di cellule somatiche in fase di amplificazione del genoma naturale. Anche se le vie molecolari alla base poliploidizzazione trofoblasto hanno cominciato a svelare, il ruolo fisiologico e il vantaggio di amplificazione del genoma trofoblasto rimane in gran parte sfuggente. Lo sviluppo delle cellule staminali in cellule diploidi trofoblasto poliploidi in cultura fa di questo<em&gt; Ex vivo</emSistema di&gt; un ottimo strumento per chiarire il meccanismo di regolazione della replicazione del genoma e l&#39;instabilità nella salute e nella malattia. Qui si descrive un protocollo basato su precedenti rapporti con modificazioni pubblicato nel Chiu<em&gt; Et al.</em&gt; 2008.

In questo video, dimostriamo l&#39;isolamento di blastocisti mouse e la derivazione di cellule staminali trofoblasto da blastocisti. Abbiamo anche descrivere le condizioni per il mantenimento della proprietà delle cellule staminali e l&#39;induzione della differenziazione nella cultura.

Derivazione di cellule staminali trofoblasto mouse da blastocisti

La specificazione del trofectoderma è uno dei primi eventi di differenziamento dello sviluppo dei mammiferi. La linea cellulare del trofoblasto, derivata dal...

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere cellule TS da blastocisti di topo. Questo viene raggiunto isolando innanzitutto i corni uterini e recuperando le blastocisti da topi gravidi. Il secondo passaggio della procedura consiste nel coltivare le blastocisti su colture di cellule della metà e in condizioni che favoriscono la crescita delle cellule TS.Il terzo passaggio della procedura consiste nell'espandere le colonie di cellule TS ed eventualmente coltivare le cellule TS in assenza di cellule feeder di metionina. L'ultimo passaggio della procedura è coltivare le cellule TS mantenendo le proprietà delle cellule staminali, al fine di effettuare la crioconservazione e indurre la differenziazione in trofoblasto. Alla fine, si possono ottenere risultati che mostrano l'espressione del marcatore delle cellule staminali del trofoblasto, ovvero CDX2, nelle cellule TS indifferenziate, oppure l'espressione del marcatore differenziato P450 SCC dopo la loro maturazione in cellule giganti del trofoblasto, mediante microscopia a immunofluorescenza.Ciao, sono Shani Chu del laboratorio del Dipartimento di Genetica Biomedica presso il Rochester Medical Center dell'Università di Rochester. Oggi vi mostreremo un procedimento di coltura di cellule staminali trofoblastiche. Utilizziamo questo procedimento per studiare la crescita e la differenziazione del trofoblasto e il suo ruolo nei tessuti extra-embryonici per la formazione di una placenta sana.Iniziamo. Per iniziare questa procedura, impostate un incrocio riproduttivo tra i topi di interesse. Successivamente, preparate i fibroblasti embrionali murini ORMs come cellule nutrici.Due giorni prima del prelievo dei blastocisti, seminare le cellule MEF in piastre da 100 millimetri per il giorno successivo. Trattare queste cellule MEF con 10 millilitri di mezzo TS contenente 20 microgrammi per millilitro di mitomicina C per due ore a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica. Dopo due ore, lavare le cellule due volte con PBS, risospendere le cellule MEF trattate con mitomicina C in 10 millilitri di mezzo TS e seminare le cellule in una piastra a 12 pozzetti. Nel giorno del prelievo dei blastocisti, sostituire il mezzo di coltura delle cellule MEF con mezzo TS aggiunto di FGF 1X e eparina.Ora siamo pronti a raccogliere gli embrioni dal collo dell'utero del topo. Innanzitutto, posizionare l'animale sacrificato supino e pulire la pelle e il pelo con etanolo al 70%. Successivamente, praticare un piccolo taglio laterale, tirare la pelle verso la testa per esporre l'addome e incidere lateralmente il peritoneo.Per esporre la cavità addominale, individuare l'utero. Rimuovere l'utero afferrandolo con una pinzetta al collo dell'utero situato dietro la vescica e recidendo la giunzione tra utero e collo dell'utero. Estrarre l'utero e rimuovere la membrana e il tessuto adiposo.Quindi tagliare l'utero al di sotto della giunzione con l'ovidotto. Posizionare l'utero in 0,2 millilitri di mezzo TS in una piastra da 60 millimetri. Ora riempire una siringa da un millilitro con un millilitro di mezzo TS.Applicare un ago da 26 gauge e inserirlo alla base di un utero. Lavare lentamente in una nuova piastra da 60 millimetri. Durante il lavaggio, l'utero dovrebbe gonfiarsi e distendersi completamente.Nello stesso modo, lavare l'altro corno uterino utilizzando una pipetta controllata con la bocca. Raccogliere e trasferire la blastocisti. Assistere con attenzione in una piastra pulita a 12 pozzetti contenente mezzo TS, lavando la blastocisti per tre volte mediante trasferimento seriale attraverso il mezzo TS in piastre a 12 pozzetti.Posizionare un blastoassist per pozzetto. In una piastra a 12 pozzetti contenente i feeder trattati con mitomicina C, coltivare a 37 gradi Celsius in un'atmosfera contenente il 5% di anidride carbonica. I blastoassist schiuderanno dalla zona pellucida e si attaccheranno ai pozzetti in 24-36 ore.Al terzo giorno sarà facilmente osservabile una piccola espansione. Alimentare le colture con 500 microlitri di mezzo TS fresco più un X FGF quattro eparina al quarto o al quinto giorno. L'espansione del blasto assistito dovrebbe essere pronta per la disgregazione in base alle sue dimensioni.La dimensione ideale per la disaggregazione dei TSL è illustrata qui. Lavare le colture una volta con 0,5 millilitri di PBS. Quindi aggiungere 100 microlitri di tripsina 0,25% in EDTA e incubare per cinque minuti a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica.Ora siamo pronti a frammentare i blasti, che è probabilmente la parte più critica di questa procedura. Successivamente, frammentare l'espansione assistita dei blasti in piccoli grumi pipettando ripetutamente su e giù in modo vigoroso con una pipetta P100; arrestare la tripsinizzazione aggiungendo 0,5 millilitri di mezzo 70 cm 1,5 F four H nel pozzetto e reinserire immediatamente le cellule nell'incubatore. Otto ore dopo la disgregazione, sostituire il mezzo.Continuare a nutrire le cellule ogni due giorni tra il sesto e il decimo giorno. E questa fase è altamente variabile. Possono essere osservate colonie di TSL.Hanno una morfologia piatta, simile a un foglietto epiteliale, con un confine della colonia ben definito. Continuare a nutrire le colture ogni due giorni quando le cellule TS raggiungono una confluenza del 50%, solitamente tra i giorni 15 e 20. Lavare una volta con PBS e aggiungere 100 microlitri di tripsina 0,25% EDTA, pipettando su e giù durante la tripsinizzazione per garantire una sospensione quasi monocellulare.Dopo cinque minuti, arrestare la tripsina aggiungendo sette DCM 1.5 F quattro H medium. Quindi trasferire le cellule in nuove piastre a sei pozzetti contenenti i feeder di metionina trattati con mitomicina C precedentemente preparati e incubare a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica. Cambiare il mezzo otto ore dopo il passaggio e continuare a nutrire le colture ogni due giorni. Dopo uno o due passaggi aggiuntivi sui feeder di metionina, le TSL possono essere coltivate senza di essi per separare le TSL dai feeder di metionina.Dopo il passaggio, incubare le cellule coltivate a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per 30 minuti. Poiché le cellule mes si attaccano alla piastra di coltura molto più rapidamente rispetto alle cellule TS dopo la tripsinizzazione, la maggior parte delle cellule mes si attaccherà alla piastra mentre la popolazione di cellule TS rimarrà in sospensione. Trasferire il sopranatante in una nuova piastra.Ripetere questo processo di separazione delle cellule TS dalle cellule nutritizie per diversi passaggi al fine di ottenere una popolazione pura di cellule TS. Mantenere le cellule TS in mezzo 70 cm, 1,5 F four H e passarle ogni quattro giorni o quando la coltura raggiunge una confluenza del 70%. Infine, l'identità delle cellule TS può essere confermata mediante immunomarcatura di un marcatore cellulare.CDX due per congelare le cellule TS, raccoglierle mediante izzazione, seguita da centrifugazione a 450 GS per sei minuti. Resus sospendere le cellule in mezzo TS con un volume uguale di mezzo di congelamento 2x e trasferirle in provette criogeniche. Una piastra da 60 millimetri che è al 70% confluenta viene di solito conservata in due provette.Congelare lentamente le cellule utilizzando una camera di alcol isopropilico a meno 70 gradi Celsius. Trasferire in azoto liquido dopo 24-48 ore. Lo scongelamento delle TSL deve essere eseguito rapidamente scongelando la provetta a 37 gradi Celsius.Trasferire le cellule haw in un tubo da 15 millilitri contenente 10 millilitri di terreno TS e raccogliere le cellule mediante centrifugazione; risospendere le cellule in 70 cm, 1,5 F quattro H e seminare ogni fiala di cellule in una piastra da 60 millimetri. La differenziazione delle cellule TS in cellule giganti trofoblastiche, o tgc, può essere indotta rimuovendo il MEC quattro e l'eparina. Le tgc sono facili da identificare in coltura per via di nuclei e corpi cellulari ingranditi.Il fenotipo TGC può essere rilevato anche mediante colorazione immunohistochimica di un marcatore TGC, P450 SCC, mostrato in verde, e controcolorazione con DAPI mostrata in rosso, come osservato in questo caso. Le cellule differenziate esprimono P450 SCC, mentre le cellule indifferenziate non lo esprimono. L'analisi citometrica delle cellule differenziate colorate con ioduro di propidio mostra ulteriormente un contenuto maggiore di DNA, dove M1 rappresenta da due a quattro copie e M2 rappresenta più di quattro copie di DNA.Questi risultati suggeriscono che le TSL subiscono una reduplicazione endomitotica per diventare TCS poliploidi rappresentate dalla popolazione M due. Mostriamo semplicemente come raccogliere blastocisti, ptosi e derivare cellule TS murine da blastocisti, ptosi. È importante ricordare di monitorare attentamente l'espansione cellulare durante l'allestimento delle linee TSL, assicurandosi che la loro pluripotenza venga mantenuta nelle condizioni di coltura.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

derivation-of-mouse-trophoblast-stem-cells-from-blastocysts

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Questa dettagli del protocollo la derivazione di cellule staminali ematopoietiche trapiantabili da topo cellule staminali embrionali (ESC) e la loro successiva iniezione in topi irradiati letalmente destinatario. In breve, ESC si differenziano come corpi embrionali, che sono poi infettati con HoxB4 retrovirali e co-coltura con cellule stromali OP9 e citochine ematopoietiche.

Derivazione di cellule staminali ematopoietiche da cellule staminali embrionali murini

La capacità di cellule staminali embrionali umane per auto-rinnovarsi e differenziarsi in tutti i tipi di cellule del corpo suggerisce che essi sono molto promettenti per le applicazioni mediche e come strumento di ricerca per affrontare questioni fondamentali per lo sviluppo e la malattia. Qui, mettiamo a disposizione una concisa, passo-passo il protocollo per la derivazione di cellule staminali embrionali umane da embrioni da immunosurgical isolamento della massa cellulare interna.

Derivazione di cellule staminali embrionali umane da Immunosurgery

La capacità di cellule germinali embrionali di differenziarsi in cellule germinali primordiali durante le prime fasi di sviluppo è un modello perfetto per affrontare la nostra ipotesi sul cancro e la sterilità. Questo protocollo mostra come isolare le cellule germinali primordiali di gonadi in via di sviluppo 10,5-11,5 embrioni giorni post coitum mouse.

L&#39;isolamento e la derivazione di cellule embrionali del mouse Germinal

In questo protocollo, si descrive la dissezione placentae dal mouse sulla gravidanza D10.5, seguito da isolamento di cellule trofoblastiche mediante gradiente di Percoll. Abbiamo poi dimostrare l'utilizzo delle cellule isolate in un saggio di invasione Matrigel.

Isolamento di cellule primarie trofoblasto mouse e Invasion Assay trofoblasto

Qui presentiamo un protocollo per la conversione diretta di fibroblasti embrionali murini in cellule staminali del trofoblasto completamente funzionali e stabili mediante sovraespressione di dieci giorni di Tfap2c, Gata3, Eomes ed Ets2.

Protocollo per la conversione diretta dei fibroblasti murini embrionali in trofoblasto cellule staminali

Qui, presentiamo un protocollo per generare in modo efficiente cellule trofoblastiche umane da cellule staminali pluripotenti umane utilizzando la proteina morfogenica ossea 4 e inibitori delle vie Activina/Nodale. Questo metodo è adatto per la differenziazione efficiente delle cellule staminali pluripotenti umane e può generare grandi quantità di cellule per la manipolazione genetica.

La differenziazione in vitro di pluripotenti umane Cellule Staminali in cellule trofoblastiche

Questo articolo descrive un protocollo per derivare e cultura pluripotenti linee di cellule staminali da embrioni di topo allo stadio di blastocisti efficacemente.

Derivazione di linee di cellule staminali da embrioni di Preimplantation Mouse

Qui, descriviamo un metodo per riscaldare le blastocisti umani vetrificati, maficandoli attraverso il periodo di impianto in vitro, digerindoli in singole cellule e raccogliendo cellule trofoblaste precoci per ulteriori indagini.

Raccolta a cella singola di cellule di trofoblasto in peri-impianto Stadio Embrioni Umani

Un protocollo che delinea la formazione di blastoidi umani che generano in modo efficiente, tempestivo e sequenziale cellule simili a blastocisti.

Protocollo per lo sviluppo e l'impianto di blastocisti umani per la modellazione di blastocisti

In questo video ci dimostra come isolare le cellule staminali della retina dalla epitelio ciliare dell'occhio del mouse e farle crescere in coltura per formare clonale sfere della retina. Le sfere che sono isolati possiedono le caratteristiche cardine delle cellule staminali: l'auto-rinnovamento e multipotenzialità.

Isolamento di cellule staminali della retina dalla Eye mouse

Impara a derivare cellule staminali trofoblasto da blastocisti murine per studiare la biologia del trofoblasto e lo sviluppo placentare. Questo metodo permette di mantenere le proprietà staminali e indurre la differenziazione in vitro.

Derivazione di cellule staminali trofoblasto mouse da blastocisti

Esplora altri video