Analisi dell'espressione genica in Borer Emerald Ash ( Agrilus planipennis) Utilizzando quantitativa Real Time-PCR

L'obiettivo generale del seguente esperimento è analizzare l'espressione genica in tessuti e stadi di sviluppo del bostrico del frassino utilizzando la PCR quantitativa. Questo viene ottenuto mediante dissezione dei tessuti larvali e classificazione degli stadi di sviluppo. Come secondo passaggio, si estrae l'RNA da tessuti e stadi di sviluppo utilizzando il reagente triolo, che viene poi usato come stampo per generare il primo filamento di cDNA; successivamente alla sintesi del primo filamento di cDNA, viene eseguita la qRT-PCR.

Si ottengono risultati che mostrano un'espressione differenziale del gene bersaglio in diversi tessuti larvali e stadi di sviluppo, basati sui dati completi di variazione ottenuti dai valori di soglia del ciclo. Dopo le amplificazioni R-T-P-C-R quantitative. Ciao, sono Prakash Mi, il responsabile scientifico di questo laboratorio presso il Dipartimento di Entomologia della Ohio State University.

Il mio laboratorio si concentra principalmente sugli aspetti genomici e molecolari delle interazioni tra emal, lash, burer e ash. L'emal, lash burer o EAB è un parassita esotico invasivo proveniente dalla Cina che minaccia l'esistenza stessa delle popolazioni di alberi di ash in tutta l'America del Nord. Oggi vi mostreremo un protocollo per l'analisi dell'espressione genica nell'EAP mediante QPCR, o PCR quantitativa in tempo reale.

E i membri del laboratorio che parteciperanno a questo protocollo sono Swapna Priou, che effettuerà le dissezioni dei valvole, e Bin Bandari, che mostrerà l'isolamento dell'RNA. Infine, Lauren Rivera Vega eseguirà l'analisi QPC. Utilizziamo anche questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare l'espressione genica di ash.

Quindi iniziamo. Prima dell'inizio di questa procedura, posizionare i larvi di emerald ash B o EAD su carta filtro umida. Fino a quando non verranno eseguite le dissezioni, mantenere la soluzione salina fosfato fresca e appena preparata al 1x o PBS in ghiaccio per mantenere il tampone freddo durante tutta la dissezione.

Per iniziare, fissare le larve di EAB sulla piastra di dissezione utilizzando perni da dissezione fini. Quindi aggiungere PBS 1x freddo sulla piastra di dissezione. Prima staccare la testa delle larve con un paio di forbici da dissezione fini.

Successivamente, rimuovere l'ultimo segmento addominale delle larve utilizzando una pinzetta da orologiaio. Sollevare la cuticola dal cadavere larvale, quindi praticare un'incisione lungo tutta la lunghezza del cadavere con un paio di forbici. Prestare attenzione a non rompere l'intestino.

Dopo aver praticato l'incisione, isolare con attenzione il tessuto del mesenterio dagli altri tessuti, come i corpi adiposi e il tessuto connettivo. Quindi risciacquare il tessuto in 1 ml di tampone XPBS fresco per assicurarsi che non vi sia contaminazione da corpo adiposo. Trasferire il mesenterio in 500 microlitri di reagente triolo pre-raffreddato in un tubo eppendorf da 1,5 millilitro.

Successivamente, isolare il tessuto del corpo grasso utilizzando pinzette e trasferirlo in una provetta eppendorf da 1,5 millilitri contenente 500 microlitri di reagente triol freddo. Infine, isolare il tessuto della cuticola dalla carcassa larvale raschiando via eventuali tessuti aderenti, avendo cura di non danneggiare l'integrità del tessuto.

Risciacquare il tessuto di cuticola isolato in tampone PBS fresco e trasferirlo in una provetta eppendorf da 1,5 millilitri contenente 500 microlitri di reagente triazolico freddo. La cuticola isolata, il corpo adiposo e i tessuti del midgut possono essere conservati a meno 80 gradi Celsius fino all'estrazione dell'RNA. In previsione dell'estrazione dell'RNA, suddividere i diversi campioni di EAB in base agli stadi di sviluppo.

Queste fasi includono la prima, seconda, terza e quarta stella, PrepU e adulti. Per iniziare l'estrazione dell'RNA, omogeneizzare innanzitutto i tessuti con pestelli di plastica nei tubi Eppendorf da 1,5 millilitro contenenti il triolo. Dopo l'omogeneizzazione, portare il volume totale di ciascun campione a un millilitro con il reagente triolo.

Per le fasi di sviluppo, omogeneizzare l'intero animale in azoto liquido utilizzando un mortaio e un pestello. Quindi aggiungere un'aliquote dell'omogenato a un millilitro di triolo. Incubare i tubi del campione con un millilitro di triolo per 15 minuti a temperatura ambiente.

Dopo l'incubazione, aggiungere immediatamente 200 microlitri di cloroformio a ogni provetta subito dopo l'aggiunta del cloroformio. Agitare vigorosamente le provette per circa 15 secondi. Successivamente, incubare le provette a temperatura ambiente per altri due o tre minuti.

Successivamente, centrifugare i campioni a 12.000 ×g per 15 minuti a due gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, l'RNA si troverà nella fase acquosa. Il volume della fase acquosa dovrebbe essere di 600 microlitri o del 60% del volume totale del triolo.

Rimuovere con attenzione solo la fase acquosa. La presenza di sostanze al di sotto della fase acquosa provocherà contaminazione dell'RNA estratto. Successivamente, trasferire la fase acquosa in una provetta einor da 1,5 millilitri opportunamente etichettata.

Per precipitare l'RNA dalla fase acquosa, aggiungere 0,5 millilitri di alcol isopropilico a ogni provetta. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 minuti. Dopo l'incubazione, centrifugare le provette a 12.000 ×g per 10 minuti a due gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante dalle provette.

L'RNA è presente nel pellet di consistenza gelatinosa formato sul fondo del tubo. Lavare il pellet con etanolo al 75%, aggiungendo almeno un millilitro di etanolo al 75% per ogni millilitro di campione miscelato mediante vortex. Successivamente, centrifugare i tubi a 7.500 ×g per cinque minuti a due gradi Celsius.

Scartare il soprannatante dai tubi. Centrifugare nuovamente i tubi nella piccola centrifuga da banco per un minuto. Rimuovere qualsiasi eccedenza di soprannatante dal tubo mediante pipettaggio accurato.

Lasciare il tubo aperto e far asciugare il pellet all'aria per cinque-dieci minuti. Prestare attenzione a non eccessivamente disidratare il pellet, poiché ciò ridurrebbe notevolmente la sua solubilità dopo l'essiccazione all'aria. Risospendere il pellet in percarbonato di ditale o in acqua trattata dep sea.

La quantità di acqua utilizzata per risospendere il pellet dipenderà dalle dimensioni del pellet. Utilizzare 50 microlitri di acqua di mare depurata per un pellet piccolo o 100 microlitri per un pellet grande. Lasciare che il pellet si sciolga completamente nell'acqua di mare depurata muovendo la punta della pipetta su e giù più volte.

Dopo che il pellet si è disciolto, incubare il campione a 55 gradi Celsius per 10 minuti. Successivamente, misurare la concentrazione di ciascun campione di RNA utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop. Infine, eseguire la sintesi del primo filamento di cDNA per i rispettivi campioni di RNA utilizzando il sistema Invitrogen SuperScript per la sintesi del primo filamento per RT-PCR.

Questa procedura può essere trovata nella parte scritta di questo protocollo. Per iniziare la progettazione della PCR quantitativa in tempo reale o Q-R-T-P-C-R, progettare ogni primer in modo che abbia una temperatura di fusione di 60 gradi Celsius e una dimensione del prodotto di circa 100 paia di basi. AP par uno viene utilizzato come gene di interesse per questo esperimento.

Per l'analisi e la normalizzazione successiva dei dati è necessario un gene di riferimento o un controllo interno. In questo caso, la proteina ribosomiale a P RRP1 viene utilizzata come gene di riferimento. Successivamente, progettare un modello che indichi il nome del campione per ogni pozzetto e la piastra QR tpcr.

Ricordare di includere standard per ogni gene e almeno due replicati tecnici per campione. Quindi accendere la macchina per QRT PCR e inserire i parametri di ciclizzazione per impostare la piastra per la macchina CFX 96. Preparare innanzitutto il mix master per ogni gene in un tubo separato per ogni pozzetto.

La miscela master è composta da due microlitri di acqua priva di nucleasi, quattro microlitri di cyber green 2,5 x, un microlitro di primer forward e un microlitro di primer reverse, per un volume totale di otto microlitri. Secondo il modello progettato in precedenza, aggiungere due microlitri di cDNA a ciascun pozzetto. Successivamente, aggiungere otto microlitri della miscela master in ogni pozzetto, ottenendo un volume totale di 10 microlitri per reazione; aspirare e dispensare più volte per assicurare un'adeguata miscelazione del campione.

Verificare che nessun liquido rimanga sulla punta. Per evitare contaminazioni incrociate, utilizzare una nuova punta per ogni campione. Una volta preparata l'intera piastra, coprirla con nastro ottico.

Evitare di toccare il nastro poiché la presenza di grasso può alterare la lettura. Centrifugare quindi la piastra a 500 giri/min per un minuto per assicurarsi che tutti i prodotti nei pozzetti si trovino sul fondo della piastra dopo la centrifugazione. Verificare che non ci siano ghiaccio o acqua sulla parte inferiore della piastra.

Infine, posizionare la piastra nella macchina QR TPCR ed eseguire il programma PCR rappresentativo per larve di EAB. Qui vengono mostrate la dissezione e la QR TPCR. La dissezione della larva di EAB dovrebbe rivelare il midgut al centro della larva di EAB.

Il midgut della larva di EAB viene isolato come mostrato qui, valori medi di espressione relativi o RAV. Per il gene della paratrophina AP par1, vengono mostrati qui i valori per diversi tessuti larvali, inclusi cuticolo, midgut e corpi grassi. La proteina ribosomiale specifica per EAB, ARP1, è stata utilizzata come controllo interno per normalizzare i dati ottenuti per il gene di interesse.

È stato estratto il fold change relativo di AP AP par uno per i diversi tessuti larvali. Il tessuto della cuticola ha mostrato la minore espressione ed è stato pertanto utilizzato come campione calibratore per la media dei RV di AP Perry. Uno in diverse fasi di sviluppo dell'EAB, inclusi il primo, secondo, terzo e quarto stadio larvale.

Il PrepU e gli adulti sono stati determinati utilizzando aprp uno come controllo interno per normalizzare i dati. È stato determinato il cambio relativo di trascrizione di AP Perry uno in varie fasi di sviluppo. In questo caso, il campione PrepU ha mostrato il livello minimo di mRNA ed è stato quindi utilizzato come campione di calibrazione.

È stato appena mostrato come eseguire dissezioni laterali e successivamente l'analisi dell'espressione genica utilizzando la regione laterale, nonché diverse fasi di sviluppo di Emeral ra, mediante R-T-P-C-R quantitativo durante questa procedura. È necessario prestare attenzione durante la dissezione per evitare contaminazioni incrociate tra i campioni di tessuto. Inoltre, si deve fare attenzione durante l'esecuzione della Q-R-T-P-C-R per assicurarsi di pipettare i campioni corrispondenti nella rispettiva piastra PCR.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato il nostro video e buona fortuna con i vostri esperimenti.