Etichettatura e cellule Imaging nel romboencefalo Zebrafish

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di ottenere immagini di cellule neurali ad alta risoluzione nell'embrione di pesce zebra. Inizialmente, un DNA che codifica per una proteina fluorescente verde mirata alla membrana viene iniettato in un embrione di pesce zebra allo stadio ad una singola cellula, determinando un'ereditarietà a mosaico che consente un miglioramento dell'immagine di cellule sparse. Gli embrioni vengono quindi marcati mediante immunomarcatura con anticorpi anti-GFP e sezionati, permettendo la visualizzazione della morfologia di singole cellule ad alta risoluzione in un preparato fissato. In alternativa, embrioni vivi possono essere analizzati mediante microscopia video a intervalli per ottenere immagini della dinamica cellulare.

Si ottengono risultati che mostrano la morfologia o la dinamica cellulare. Qui, il cervello posteriore del pesce zebra viene analizzato mediante microscopia confocale. Ciao a tutti.

Sono PR Chandran del laboratorio della dottoressa Rachel Brewster del dipartimento di scienze biologiche dell'Università del Maryland a Baltimore County. Oggi vi mostreremo un procedimento per etichettare e visualizzare cellule neurali nell'embrione di pesce zebra con una risoluzione più elevata. Utilizziamo normalmente questo procedimento in laboratorio per studiare i meccanismi della neurogenesi nell'embrione di pesce zebra a livello cellulare.

Iniziamo. Posizionare salviette umide Kim intorno al bordo di una piastra di Petri da 100 millimetri.

Fissare con attenzione un ago di vetro per microiniezione su una striscia di cera all'interno della piastra umidificata. Sotto un microscopio stereoscopico da dissezione, allineare l'ago rispetto a un vetrino graduato. Per ottenere una punta delle dimensioni appropriate, utilizzare una lametta pulita per battere delicatamente sull'ago nel punto in cui presenta un diametro di un micrometro.

Collegare l'ago alla pipetta dell'apparato di microiniezione, depositare 0,5 microlitri di una soluzione di rosso fenolo e acqua su un film di parafina e riempire anteriormente l'ago dalle goccioline. Impostare la pressione di microiniezione a sette chilopascal e iniziare con un impulso di 20 millisecondi. Contare il numero di impulsi necessari per erogare tutto il liquido. Variare il tempo tra 10 e 30 millisecondi in modo che siano necessari circa 250 impulsi per l'erogazione.

0,5 microlitri di soluzione. Utilizzare una micropipetta per riempire all'indietro l'ago con 0,5-1 microlitro di MG FPD NA in acqua, mescolato con rosso fenolo per la visualizzazione. Coprire la piastra umidificata per prevenire l'evaporazione della soluzione dall'ago sotto il microscopio stereoscopico.

Posizionare embrioni di pesce singoli allo stadio ad una cellula in una piastra di Petri da 60 millimetri riempita con embryo.Medium. Utilizzare pinzette fini per afferrare delicatamente la corion e stabilizzare l'embrione. Portare l'ago riempito con MGFP e rosso fenolo nell'area bersaglio per l'iniezione.

Per un'espressione diffusa di MGFP, effettuare l'iniezione nel tuorlo o nel citoplasma. Utilizzare l'apparato di microiniezione per somministrare circa due nanolitri della soluzione di MGFP. Osservare la posizione dell'indicatore rosso fenolo per confermare un'iniezione corretta.

Rimuovere con attenzione l'ago dall'embrione. Iniettare tutti gli embrioni nella piastra, fino a un massimo di 30 embrioni alla volta. Evitare di esporre gli embrioni alla luce e incubare a 28,5 gradi Celsius per consentire agli embrioni di svilupparsi fino allo stadio desiderato sotto il microscopio stereoscopico.

Utilizzare pinzette fini per staccare delicatamente il corion dagli embrioni. Usare una pipetta per pasta per rimuovere il corion vuoto dalla piastra, lasciando solo gli embrioni decoronati. Utilizzare una pipetta per pasta flame-polished per trasferire gli embrioni iniettati e decoronati in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Rimuovere il più possibile il mezzo in eccesso, quindi aggiungere un millilitro di ative. Lavare gli embrioni in una XPBS a temperatura ambiente per 3 volte, per 5 minuti ciascuna. Trasferire gli embrioni in una piastra di Petri riempita con una XPBS sotto il microscopio stereoscopico.

Utilizzare pinzette fini per tenere l'embrione vicino alla regione della coda. Usare un secondo paio di pinzette o un bastoncino per cercare di rimuovere la maggior quantità possibile di tuorlo senza toccare la regione del tronco posteriore. Osservando al microscopio stereoscopico, utilizzare le pinzette fini per sollevare l'embrione dalla piastra e trasferirlo in uno stampo per inclusione riempito con agarosio al 4% a basso punto di fusione.

Posizionare l'embrione verso un'estremità dello stampo. Lasciare solidificare l'aros a temperatura ambiente. Utilizzare una spatola per rimuovere il blocco indurito di aros dallo stampo, sollevandolo e tagliando uniformemente con la lama l'estremità inferiore del blocco.

Se lo si desidera, utilizzare una goccia di colla istantanea per fissare il blocco sul lato tagliato della piattaforma vibrante, posizionandolo a faccia in giù. Allineare più blocchi sulla piattaforma. Fissare la piattaforma al vibrato.

Assicurarsi che la lama tagli completamente ogni embrione, senza però attraversare del tutto il blocco. Riempire la piastra con una sezione di XPBS. Tagliare con attenzione gli embrioni fino alla parte posteriore di un blocco di agarosio e trasferirli in una piastra di Petri riempita con XPBS.

Separare i sezioni sotto il microscopio stereoscopico. Utilizzare pinzette fini per posizionare le sezioni desiderate in una piastra multi-pozzetti riempita con un XPBS. Utilizzare un pozzetto diverso per ogni embrione.

Colorare le sezioni con DPI ed etichettare mediante immunomarcatura con anti GFP. In caso contrario, effettuare l'acquisizione delle immagini entro 48 ore. Montare fino a sei sezioni per vetrino e posizionare un coprioggetti sopra le sezioni per l'analisi al microscopio confocale.

Conservare le preparazioni al buio per evitare lo sbiancamento fotoindotto. Per l'analisi in tempo reale, gli embrioni iniettati con MGFP devono essere protetti dalla luce. Utilizzare pinzette per rivestire gli embrioni 30 minuti prima che raggiungano lo stadio di sviluppo desiderato.

Trasferire gli embrioni rivestiti in una soluzione sedativa di mezzo per embrioni con lo 0,01% di Trica e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Pipettare una goccia di agarosio al 1% in acqua su una piastra per colture da 35 millimetri con fondo in vetro, in modo che riempia lo stampo. Lasciare solidificare l'agarosio.

Utilizzare il tubo capillare di vetro da 90 millimetri per creare tre fori nella goccia di aros sotto il microscopio stereoscopico. Esaminare il fondo della piastra ed eliminare eventuali residui di aros con pinzette. Riempire la piastra con mezzo per embrioni sotto il microscopio stereoscopico.

Utilizzare una pipetta per pasta per trasferire un embrione in ogni foro degli aros. Utilizzare pinzette fini per orientare l'embrione in modo che l'area di interesse, in questo caso la testa dorsale, sia a contatto con il vetro. Coprire la piastra.

Trasportare con attenzione la piastra sul palchetto di un microscopio confocale. Utilizzare termoventilatori per mantenere gli embrioni a 28,5 gradi Celsius per tutta la durata dell'acquisizione delle immagini. Qui è mostrata una sezione del romboencefalo di un embrione di tipo selvatico a quattro-cinque somiti, marcato con doppia colorazione: GFP legata alla membrana in verde e D in blu; un'unica cellula è marcata con GFP legata alla membrana, consentendo un'acquisizione ad alta risoluzione della morfologia e dell'organizzazione cellulare.

Questa è un'immagine comparabile del cervello posteriore di un mutante nardi din a stadi compresi tra quattro e cinque somiti. Questa immagine rivela che le cellule nei mutanti nardi non riescono a orientarsi correttamente verso la linea mediana durante la neurulazione. A differenza del metodo per la marcatura delle cellule con MGFP, l'etichettatura del cervello posteriore con un marcatore generale della superficie cellulare come la beta-catenina non permette di visualizzare la morfologia delle singole cellule.

L'acquisizione di immagini in time-lapse del cervello posteriore di un embrione etichettato con MG FP rivela che i comportamenti cellulari che guidano la neurogenesi nel pesce zebra sono molto dinamici e comprendono l'estensione di protrusioni della membrana durante la migrazione e l'intercalazione cellulare. Vi abbiamo appena mostrato come preparare embrioni di pesce zebra fissati e vitali per l'acquisizione di immagini a livello di singola cellula ad alta risoluzione. Questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.