Modello di ischemia cerebrale focale da occlusione endovascolare Sutura della arteria cerebrale media nel ratto

In questo video, illustreremo un metodo per indurre un infarto cerebrale mediante occlusione endovascolare dell'arteria cerebrale media nel ratto. Questo è un modello animale ampiamente utilizzato nella ricerca sugli ictus, che provoca ischemia nella corteccia cerebrale così come in strutture sottocorticali, inclusi i gangli della base e l'ipotalamo. Questo modello può indurre un'ischemia cerebrale sia permanente che transitoria.

A seconda che la sutura intraluminale venga lasciata in sede o rimossa dopo un periodo di tempo definito. L'ischemia cerebrale produce un core di infarto in cui avviene la morte cellulare e una regione peri-ischemica detta penombra, in cui è possibile un certo recupero cellulare. Prima di iniziare, prendiamoci un momento per descrivere i passaggi che seguiremo.

Qui vediamo un diagramma semplificato del sistema circolatorio cranico del ratto. In questo intervento chirurgico, esporremo l'arteria carotide sinistra in prossimità della biforcazione dell'arteria carotide comune, o CCA, nell'arteria carotide esterna, la ECA, e nell'arteria carotide interna, la ICA. Due piccoli rami della ECA, l'arteria occipitale e l'arteria tiroidea superiore, verranno legati mediante coagulazione bipolare e la ECA verrà occlusa distalmente rispetto a questi due rami. Utilizzando un filo di seta, verranno posizionate clip microvascolari sull'arteria carotide comune e sull'arteria carotide interna.

Un filo di sutura in monofilamento di nylon con una punta rivestita in silicone verrà quindi inserito attraverso un'incisione nell'arteria carotide esterna (ECA) e guidato verso l'alto nell'arteria carotide interna (ICA). Questo filo intraluminale viene legato delicatamente in posizione con un filo di seta attorno all'ECA prima di rilasciare la clip microchirurgica dall'ICA. Il filo di sutura intraluminale in nylon viene quindi avanzato di circa due centimetri fino a quando la punta in silicone ostruisce l'origine dell'arteria cerebrale media (MCA).

Il secondo microclips viene rimosso dall'arteria carotide comune (CCA) e viene cronometrato il periodo di occlusione. Ora che abbiamo esaminato brevemente la procedura, passiamo all'intervento chirurgico. Preparare il ratto come si farebbe per qualsiasi procedura chirurgica seguendo le linee guida per la cura degli animali della propria istituzione; si induce l'anestesia nel ratto utilizzando isoflurano al 5% con un flusso di un litro al minuto di ossigeno e un litro al minuto di protossido di azoto, quindi si riduce la concentrazione di isoflurano all'1-2% per il mantenimento dell'anestesia.

Una volta raggiunto il piano anestetico, applichiamo un unguento oftalmico artificiale su entrambi gli occhi e raschiamo il collo con un rasoio elettrico. La zona viene quindi disinfettata con soluzione di betadina seguita da etanolo al 70%. Questo processo deve essere ripetuto per un totale di tre cicli di sciacqui con Betadina ed etanolo al 70%.

Il neonato viene posizionato in un calzino sterile e adagiato su una coperta termoregolatrice. Per prevenire l'ipotermia. È utile sollevare leggermente il collo inserendo un tubo conico da 15 ml sotto la testa del neonato.

Questo agevolerà l'esposizione delle arterie carotidee in un secondo momento. Infine, vengono iniettati sottocute 0,2 ml di una soluzione al 0,5% di bupivacaina lungo il sito d'incisione previsto, al fine di garantire un sollievo dal dolore postoperatorio sotto un microscopio operatorio. Eseguire un'incisione mediana utilizzando una lama di bisturi n. 10.

La dissezione rimanente verrà eseguita sul lato sinistro dell'animale rispetto alla linea mediana. Iniziare a dissezionare attraverso la fascia superficiale. Questa operazione viene effettuata utilizzando una combinazione di dissezione ottusa e affilata.

Del tessuto ghiandolare esteso è visibile lateralmente, mentre il grande muscolo sternoioideo si trova sulla linea mediana. Utilizzare applicatori con estremità di cotone per dissezionare la ghiandola lateralmente e il muscolo sternoioideo medialmente. Sotto il tessuto ghiandolare, si osserveranno i muscoli digastrico e sternocleidomastoideo, che insieme al muscolo sternoioideo sulla linea mediana formano un triangolo muscolare sottile il cui apice è cerchiato.

È all'interno di questo triangolo che la dissezione proseguirà fino all'arteria carotidea. Utilizzare forbici microchirurgiche per tagliare la fascia che ricopre i muscoli. Questo permetterà la retrazione dei muscoli per esporre i vasi sottostanti.

Gli applicatori con punta di cotone possono essere utilizzati per retrarre i muscoli e mettere in vista le arterie comuni, esterne, profonde ed interne. Proseguire l'esposizione dell'arteria carotide esterna lungo i suoi rami, il che richiederà una dissezione precisa e accurata dei vasi.

L'obiettivo di questi passaggi è liberare l'arteria carotide esterna (ECA) e l'arteria carotide interna (ICA) dal tessuto connettivo sottostante. Continuare a dissezionare l'ECA in senso longitudinale. Si noti che potrebbe presentarsi l'osso dell'arcata zigomatica (HI) e ciò limiterà l'estensione della dissezione in direzione rostrale.

Il nervo vago, che appare bianco, si osserva decorrere lungo l'aspetto laterale delle arterie carotide comune e carotide interna, ed è stato dissezionato con precisione dalla CCA e dalla ICA. Anche due rami provenienti dall'ECA sono stati dissecati con precisione. Il primo ramo diretto lateralmente è l'arteria occipitale e il secondo ramo diretto medialmente è l'arteria tiroidea superiore.

Entrambi i primi due rami dell'ECA vengono cauterizzati e successivamente recisi. Il taglio di questi rami consente una maggiore facilità nel mobilizzare i vasi. Più avanti nella procedura, utilizzando un punto di sutura in seta, legare saldamente l'ECA il più distalmente possibile.

Posizionare un altro punto di sutura in seta in modo lento attorno all'ECA a monte della biforcazione dell'arteria carotide comune. Assicurarsi di non ostruire il vaso con questo legamento, poiché il filo endovascolare utilizzato per l'occlusione dell'arteria cerebrale media passerà attraverso questa porzione dell'ECA; posizionare clip microvascolari sia sull'arteria carotide comune che sull'arteria carotide interna.

Questa posizione è leggermente distante rispetto all'origine dell'ECA. Successivamente, creare una arterotomia parziale tra i due legami di sutura in seta dell'ECA. Una piccola quantità di sangue residuo potrebbe fuoriuscire, ma un'emorragia abbondante indica probabilmente un posizionamento errato delle clip microvascolari.

In questo caso, accertarsi che nessun tessuto sottostante sia stato intrappolato tra le lame della clip, impedendone la chiusura completa. Il passaggio successivo consiste nell'inserire un tratto di tre centimetri di sutura in nylon monofilamento nell'ECA. È utile segnare la sutura a due centimetri dalla sua punta rivestita di silicone.

Questi fili di sutura sono disponibili in commercio e il diametro della punta e la lunghezza del rivestimento in silicone possono essere personalizzati secondo le proprie specifiche, in base all'età e al peso dei ratti che si utilizzeranno. Per ratti del peso di 300 grammi, utilizziamo un diametro della punta di 0,39 millimetri e una lunghezza del rivestimento in silicone di due-tre millimetri su un filo di nylon da quattro ottavi. Introdurre il filo di sutura in nylon occlusivo nel lume dell'arteria carotide esterna dirigendolo verso l'arteria carotide comune.

Stringere il punto di sutura in seta intorno al moncone dell'ECA per fissare la sutura intraluminale in nylon ed evitare emorragie. Recidere la porzione residua dell'ECA per liberare il moncone e posizionare il moncone dell'ECA al di sotto del punto di biforcazione in modo che risulti approssimativamente allineato con l'arteria carotide interna. Ciò consentirà più facilmente lo scorrimento della sutura intraluminale all'interno dell'arteria carotide interna.

Rimuovere la clip microvascolare dall'ICA. Ricordare di aprire lentamente le clip per verificare la presenza di sanguinamento prima di rimuoverle completamente. Continuare ad avanzare il filo di nylon all'interno del lume dell'ICA fino a quando non raggiunge l'arteria cerebrale media.

Questa lunghezza è tipicamente di circa due centimetri ed è la ragione per cui si applica un segno sul filo di sutura prima dell'inserimento. Dopo aver inserito una lunghezza variabile di filo di sutura in nylon, si può avvertire una resistenza; se tale resistenza si verifica quando gran parte del filo di sutura in nylon è ancora esterna al vaso, è probabile che il filo stia entrando nell'arteria tegoplatina. In questo caso, ritirare leggermente il filo e curvarlo appena per proseguire lungo l'arteria carotide interna, che prosegue in modo più diretto.

Osservare il cambiamento di posizione del filo di sutura all'interno della luce della carotide interna in queste due immagini di confronto. Procedere spingendo il filo di sutura attraverso la carotide interna fino a quando la maggior parte del filo è inserita e si avverte nuovamente resistenza in corrispondenza di questo punto. Il filo intraluminale ha ostruito l'origine dell'arteria cerebrale media.

Avviare il cronometro e registrare l'occlusione. Tempo di inizio. Rimuovere l'altro clip microvascolare dalla CCA, chiudere rapidamente e con cura l'incisione.

Posizionare il ratto in una gabbia di recupero. Verificare che il fondo della gabbia intorno al naso e alla bocca sia privo di materiale di lettiera poco prima che termini il periodo di occlusione, anestetizzare il ratto e riaprire l'incisione rimuovendo i punti di sutura. Applicare una microclip sulla ACF come in precedenza.

Estrarre parzialmente il punto di legatura occlusivo dalla CIA fino a quando l'estremità del filo non diventa visibile attraverso la CIA. Non rimuovere ancora completamente il filo. Tuttavia, posizionare un'altra clip microscopica sulla CIA al di sopra del punto in cui si trova il filo intraluminale, rimuovere completamente il punto di legatura occlusivo e legare il moncone della ECA.

Registrare l'ora di inizio della riperfusione. Rimuovere le microclip dall'ICA e dalla CCA inumidendole nella regione con alcune gocce di soluzione salina sterile e chiudere l'incisione con punti di sutura. Somministriamo buprenorfina a un dosaggio di 0,05 milligrammi per chilogrammo di peso corporeo per un'ulteriore analgesia postoperatoria.

Amministriamo anche cinque mililitri di soluzione salina per via intraperitoneale per garantire l'idratazione durante la fase di recupero. Dopo che il ratto si è ripreso dall'anestesia, verificare la presenza di segni comportamentali di infarto sollevando il ratto per la coda e osservando se riesce a ruotare su entrambi i lati nel test di oscillazione corporea elevata, poiché ci si aspetta che si pieghi solo verso un lato. I ratti che presentano sintomi di ictus possono anche girare in cerchio verso un solo lato durante i movimenti in campo aperto.

Qui mostriamo i risultati di 60 minuti di occlusione dell'arteria cerebrale media in ratti spontaneamente ipertesi. L'immagine di risonanza magnetica è stata eseguita 24 ore dopo l'occlusione dell'arteria cerebrale media e sono mostrate immagini pesate in T2. Questo ratto ha sviluppato un ampio infarto che coinvolge sia le regioni corticali sia quelle striatali.

L'area iperintensa sulla risonanza magnetica è evidenziata in giallo, anche se qui non mostriamo i risultati. Le aree infartuate visualizzate mediante risonanza magnetica possono essere ulteriormente analizzate mediante imaging pesato in diffusione e mappe del coefficiente di diffusione apparente. Le regioni infartuate vengono inoltre confermate mediante colorazione istologica di sezioni cerebrali fresche con cloruro di triifenil tetrazolio, o TTC; la deidrogenasi nel tessuto vitale converte il substrato in un colorante rosso insolubile.

Pertanto, le regioni infartuate rimangono non colorate e appaiono bianche. Si noti che le dimensioni dell'infarto possono essere influenzate da diversi fattori, tra cui la ceppa del ratto e le dimensioni dell'animale. Utilizziamo ratti spontaneamente ipertensivi poiché producono dimensioni di infarto più costanti rispetto ad altre ceppi comunemente utilizzate, come i ratti frogg, dolly o wistar.

È inoltre importante standardizzare un peso target del ratto per ridurre le variazioni nel diametro dei vasi e, di conseguenza, nell'efficacia risultante dell'occlusione della MCAA. Speriamo che questo video si sia rivelato utile per eseguire la tecnica di occlusione della MCA nel vostro laboratorio. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.