Name: Preparazione del Drosophila Cellule S2 per la microscopia ottica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Impara a preparare le cellule S2 di Drosophila per la microscopia ottica utilizzando piastre con fondo di vetro rivestite con lectina. Questo metodo consente l'adesione e l'appiattimento cellulare per una migliore visualizzazione.

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Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal National Cancer Institute P30 CA23074, l&#39;American Cancer Society Research istituzionali di Grant 74-001-31, e l&#39;Univ. dell&#39;Arizona GI SPORE (NCI / NIH CA9506O).

<ol><li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Drosophila+S2+cells+and+their+use+for+RNAi-mediated+loss-of-function+studies+and+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy.</a> Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+EB1+is+important+for+proper+assembly%2C+dynamics%2C+and+positioning+of+the+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle.</a> J Cell Biol. 158, 873-884 (2002).</li>
<li>Goshima, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+required+for+mitotic+spindle+assembly+in+Drosophila+S2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genes required for mitotic spindle assembly in Drosophila S2 cells.</a> Science. 316, 417-421 (2007).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Per il settore della biologia cellulare, un sistema ideale dovrebbe essere poco costoso da mantenere, facile da manipolare, e suscettibili di una varietà di tecniche. Cellule di Drosophila S2 soddisfare questi requisiti, e quindi hanno rapidamente diventato il sistema di scelta per un numero crescente di cellulari laboratori di biologia. Abbiamo presentato una breve panoramica dei metodi per preparare le cellule S2 per microscopia. Una virtù notevole di cellule S2 è il fatto che cre...

<table><tbody><tr><td>S2 cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-1963</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.atcc.org/">http://www.atcc.org/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>S2 cells</td><td>DGRC</td><td>numero di stock 6</td><td>&lt;a href=&quot;https://dgrc.cgb.indiana.edu/">https://dgrc.cgb.indiana.edu/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>S2 cells</td><td>Invitrogen</td><td>R690-07</td><td></td></tr><tr><td>Sf900 II</td><td>Invitrogen</td><td>10902-096</td><td>mezzo privo di siero</td></tr><tr><td>HyClone SFX-Insect</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30278</td><td>mezzo privo di siero</td></tr><tr><td>Insect-Xpress</td><td>BioWhittaker</td><td>12-730</td><td>mezzo privo di siero</td></tr><tr><td>Mezzo Schneider&amp;rsquo;s S2</td><td>Invitrogen</td><td>11720-034</td><td>Aggiungere siero fetale bovino inattivato termicamente al 10% (concentrazione finale) per ottenere il mezzo completo.</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Invitrogen</td><td>10438026</td><td>inattivato termicamente</td></tr><tr><td>Soluzione antibiotica 100x</td><td>MP Biomedicals</td><td>91674049</td><td>contiene penicillina (10000 U/mL),&lt;br/&gt;streptomicina (10000 &amp;#x03BC;g/mL) e&lt;br/&gt;anfotericina B (25 &amp;#x03BC;g/mL)</td></tr><tr><td>Concanavalina A</td><td>MP Biomedicals</td><td>195283</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeide</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714</td><td>soluzione al 32%</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>9049</td><td>anidro, grado ACS</td></tr><tr><td>Setacci molecolari</td><td>Acros Organics</td><td>19724</td><td>tipo 3A</td></tr></tbody></table>

preparazione del drosophila cellule s2 per la microscopia ottica

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Il sistema sperimentale ideale sarebbe economico e facile da mantenere, suscettibile di una varietà di tecniche, e sarebbe sostenuto da una vasta letteratura e la sequenza del genoma del database. Colture di cellule di Drosophila S2, il prodotto di dissociato 20-24 ore embrioni vecchio 1, in possesso di tutte queste caratteristiche. Di conseguenza, le cellule S2 sono estremamente adatti per l&#39;analisi dei processi cellulari, tra cui la scoperta dei geni che codificano per i componenti molecolari del processo o meccanismo di interesse. Le caratteristiche delle cellule S2 che sono più responsabili per la loro utilità è la facilità con cui vengono gestiti, la loro squisita sensibilità a doppio filamento (ds) RNA-mediata interference (RNAi), e la loro trattabilità di microscopia a fluorescenza come sia vivo o fissa cellule. S2 cellule possono essere coltivate in una varietà di supporti, tra cui un certo numero di basso costo, disponibili in commercio, completamente definito, privo di siero dei media 2. Inoltre, crescono in modo ottimale e rapido a 21-24 ° C e può essere coltivato in una varietà di contenitori. A differenza delle cellule dei mammiferi, le cellule S2 non richiedono un ambiente regolamentato, ma invece fare bene con l&#39;aria normale e può anche essere mantenuto in contenitori sigillati. Completando la facilità di RNAi in cellule S2 è la capacità di analizzare facilmente fenotipi sperimentalmente indotta dalla fase o microscopia a fluorescenza di cellule fisse o dal vivo. Cellule S2 crescere in cultura come un monostrato unico, ma non vengono visualizzati inibizione da contatto. Al contrario, le cellule tendono a crescere in colonie nelle culture dense. A bassa densità, le culture S2 cresciuti su vetro o dei tessuti trattati con la cultura di plastica sono rotonde e vagamente-attached. Tuttavia, la citologia delle cellule S2 può essere notevolmente migliorata inducendoli ad appiattire estensivamente da colture brevemente su una superficie ricoperta con la lectina, concanavalina A (ConA) 3. Cellule S2 può anche essere stabilmente transfettate con marcatori fluorescenti-tag alle strutture etichetta o organelli di interesse in cellule vive o fissi. Pertanto, lo scenario consueto per l&#39;analisi microscopica delle cellule è questa: primo, le cellule S2 (che può possedere transgeni di esprimere marcatori tag) sono trattati con RNAi per eliminare una proteina bersaglio (s). Tempo di trattamento RNAi può essere regolata per tener conto delle differenze di proteine ​​turn-over cinetica e di ridurre al minimo il trauma cellulare / morte se la proteina bersaglio è importante per la vitalità. Successivamente, le cellule trattate vengono trasferiti in un piatto contenente un coprioggetto preverniciato con Ancona per indurre le cellule a diffondere e strettamente aderire al vetro. Infine, le cellule sono ripreso con la scelta del ricercatore di modalità di microscopia. Cellule S2 sono particolarmente buoni per gli studi che richiedono la visualizzazione estesa di cellule vive da quando queste cellule rimanere in buona salute a temperatura ambiente e l&#39;atmosfera normale.

Drosophila Schneider (S2), le cellule sono un sistema sempre più popolare per la scoperta e l&#39;analisi funzionale dei geni. Il nostro obiettivo è quello di descrivere alcune delle tecniche microscopiche, che le cellule S2 ad un sistema sempre più importante sperimentale.

Preparazione del Drosophila Cellule S2 per la microscopia ottica

Il sistema sperimentale ideale sarebbe economico e facile da mantenere, adatto a una varietà di tecniche e supportato da un'estesa letteratura...

L'obiettivo generale di questa procedura è descrivere la preparazione delle cellule S di Drosophila per la microscopia ottica. Questo viene ottenuto innanzitutto preparando delle piastre per coltura con fondo in vetro. Il secondo passaggio della procedura consiste nel rivestire il fondo in vetro con la lectina conval.Un passaggio per favorire l'adesione e l'appiattimento delle cellule S two. Il terzo passaggio della procedura consiste nell'aggiungere il mezzo di coltura e le cellule S two alla piastra di coltura. L'ultimo passaggio della procedura è fissare e immunoetichettare le cellule S two nella piastra di coltura.In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano la localizzazione di proteine d'interesse marcate con fluoro quattro o con etichetta immuno mediante microscopia a fluorescenza di cellule S due vive o fissate, rispettivamente. Ciao, sono Joey Club dal laboratorio di Greg Rogers del Dipartimento di Biologia Cellulare e Anatomia dell'Università dell'Arizona. Sono John Nye, anch'io del Rogers Lab.E sono anche Dan Buster. Sono del laboratorio di Greg Rogers. Oggi vi mostreremo un procedimento per preparare cellule di Drosophila S due per la microscopia ottica.Ut

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Impara a preparare le cellule S2 di Drosophila per la microscopia ottica utilizzando piastre con fondo di vetro rivestite con lectina. Questo metodo consente l'adesione e l'appiattimento cellulare per una migliore visualizzazione.

Preparazione del Drosophila Cellule S2 per la microscopia ottica

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