Name: Preparazione del Drosophila Cellule S2 per la microscopia ottica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Impara a preparare le cellule S2 di Drosophila per la microscopia ottica utilizzando piastre con fondo di vetro rivestite con lectina. Questo metodo consente l'adesione e l'appiattimento cellulare per una migliore visualizzazione.

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Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal National Cancer Institute P30 CA23074, l&#39;American Cancer Society Research istituzionali di Grant 74-001-31, e l&#39;Univ. dell&#39;Arizona GI SPORE (NCI / NIH CA9506O).

<ol><li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Drosophila+S2+cells+and+their+use+for+RNAi-mediated+loss-of-function+studies+and+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy.</a> Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+EB1+is+important+for+proper+assembly%2C+dynamics%2C+and+positioning+of+the+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle.</a> J Cell Biol. 158, 873-884 (2002).</li>
<li>Goshima, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+required+for+mitotic+spindle+assembly+in+Drosophila+S2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genes required for mitotic spindle assembly in Drosophila S2 cells.</a> Science. 316, 417-421 (2007).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Per il settore della biologia cellulare, un sistema ideale dovrebbe essere poco costoso da mantenere, facile da manipolare, e suscettibili di una varietà di tecniche. Cellule di Drosophila S2 soddisfare questi requisiti, e quindi hanno rapidamente diventato il sistema di scelta per un numero crescente di cellulari laboratori di biologia. Abbiamo presentato una breve panoramica dei metodi per preparare le cellule S2 per microscopia. Una virtù notevole di cellule S2 è il fatto che cre...

<table><tbody><tr><td>S2 cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-1963</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.atcc.org/">http://www.atcc.org/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>S2 cells</td><td>DGRC</td><td>numero di stock 6</td><td>&lt;a href=&quot;https://dgrc.cgb.indiana.edu/">https://dgrc.cgb.indiana.edu/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>S2 cells</td><td>Invitrogen</td><td>R690-07</td><td></td></tr><tr><td>Sf900 II</td><td>Invitrogen</td><td>10902-096</td><td>mezzo privo di siero</td></tr><tr><td>HyClone SFX-Insect</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30278</td><td>mezzo privo di siero</td></tr><tr><td>Insect-Xpress</td><td>BioWhittaker</td><td>12-730</td><td>mezzo privo di siero</td></tr><tr><td>Mezzo Schneider&amp;rsquo;s S2</td><td>Invitrogen</td><td>11720-034</td><td>Aggiungere siero fetale bovino inattivato termicamente al 10% (concentrazione finale) per ottenere il mezzo completo.</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Invitrogen</td><td>10438026</td><td>inattivato termicamente</td></tr><tr><td>Soluzione antibiotica 100x</td><td>MP Biomedicals</td><td>91674049</td><td>contiene penicillina (10000 U/mL),&lt;br/&gt;streptomicina (10000 &amp;#x03BC;g/mL) e&lt;br/&gt;anfotericina B (25 &amp;#x03BC;g/mL)</td></tr><tr><td>Concanavalina A</td><td>MP Biomedicals</td><td>195283</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeide</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714</td><td>soluzione al 32%</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>9049</td><td>anidro, grado ACS</td></tr><tr><td>Setacci molecolari</td><td>Acros Organics</td><td>19724</td><td>tipo 3A</td></tr></tbody></table>

preparazione del drosophila cellule s2 per la microscopia ottica

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Il sistema sperimentale ideale sarebbe economico e facile da mantenere, suscettibile di una varietà di tecniche, e sarebbe sostenuto da una vasta letteratura e la sequenza del genoma del database. Colture di cellule di Drosophila S2, il prodotto di dissociato 20-24 ore embrioni vecchio 1, in possesso di tutte queste caratteristiche. Di conseguenza, le cellule S2 sono estremamente adatti per l&#39;analisi dei processi cellulari, tra cui la scoperta dei geni che codificano per i componenti molecolari del processo o meccanismo di interesse. Le caratteristiche delle cellule S2 che sono più responsabili per la loro utilità è la facilità con cui vengono gestiti, la loro squisita sensibilità a doppio filamento (ds) RNA-mediata interference (RNAi), e la loro trattabilità di microscopia a fluorescenza come sia vivo o fissa cellule. S2 cellule possono essere coltivate in una varietà di supporti, tra cui un certo numero di basso costo, disponibili in commercio, completamente definito, privo di siero dei media 2. Inoltre, crescono in modo ottimale e rapido a 21-24 ° C e può essere coltivato in una varietà di contenitori. A differenza delle cellule dei mammiferi, le cellule S2 non richiedono un ambiente regolamentato, ma invece fare bene con l&#39;aria normale e può anche essere mantenuto in contenitori sigillati. Completando la facilità di RNAi in cellule S2 è la capacità di analizzare facilmente fenotipi sperimentalmente indotta dalla fase o microscopia a fluorescenza di cellule fisse o dal vivo. Cellule S2 crescere in cultura come un monostrato unico, ma non vengono visualizzati inibizione da contatto. Al contrario, le cellule tendono a crescere in colonie nelle culture dense. A bassa densità, le culture S2 cresciuti su vetro o dei tessuti trattati con la cultura di plastica sono rotonde e vagamente-attached. Tuttavia, la citologia delle cellule S2 può essere notevolmente migliorata inducendoli ad appiattire estensivamente da colture brevemente su una superficie ricoperta con la lectina, concanavalina A (ConA) 3. Cellule S2 può anche essere stabilmente transfettate con marcatori fluorescenti-tag alle strutture etichetta o organelli di interesse in cellule vive o fissi. Pertanto, lo scenario consueto per l&#39;analisi microscopica delle cellule è questa: primo, le cellule S2 (che può possedere transgeni di esprimere marcatori tag) sono trattati con RNAi per eliminare una proteina bersaglio (s). Tempo di trattamento RNAi può essere regolata per tener conto delle differenze di proteine ​​turn-over cinetica e di ridurre al minimo il trauma cellulare / morte se la proteina bersaglio è importante per la vitalità. Successivamente, le cellule trattate vengono trasferiti in un piatto contenente un coprioggetto preverniciato con Ancona per indurre le cellule a diffondere e strettamente aderire al vetro. Infine, le cellule sono ripreso con la scelta del ricercatore di modalità di microscopia. Cellule S2 sono particolarmente buoni per gli studi che richiedono la visualizzazione estesa di cellule vive da quando queste cellule rimanere in buona salute a temperatura ambiente e l&#39;atmosfera normale.

Drosophila Schneider (S2), le cellule sono un sistema sempre più popolare per la scoperta e l&#39;analisi funzionale dei geni. Il nostro obiettivo è quello di descrivere alcune delle tecniche microscopiche, che le cellule S2 ad un sistema sempre più importante sperimentale.

Preparazione del Drosophila Cellule S2 per la microscopia ottica

Il sistema sperimentale ideale sarebbe economico e facile da mantenere, adatto a una varietà di tecniche e supportato da un'estesa letteratura...

L'obiettivo generale di questa procedura è descrivere la preparazione delle cellule S di Drosophila per la microscopia ottica. Questo viene ottenuto innanzitutto preparando delle piastre per coltura con fondo in vetro. Il secondo passaggio della procedura consiste nel rivestire il fondo in vetro con la lectina conval.Un passaggio per favorire l'adesione e l'appiattimento delle cellule S two. Il terzo passaggio della procedura consiste nell'aggiungere il mezzo di coltura e le cellule S two alla piastra di coltura. L'ultimo passaggio della procedura è fissare e immunoetichettare le cellule S two nella piastra di coltura.In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano la localizzazione di proteine d'interesse marcate con fluoro quattro o con etichetta immuno mediante microscopia a fluorescenza di cellule S due vive o fissate, rispettivamente. Ciao, sono Joey Club dal laboratorio di Greg Rogers del Dipartimento di Biologia Cellulare e Anatomia dell'Università dell'Arizona. Sono John Nye, anch'io del Rogers Lab.E sono anche Dan Buster. Sono del laboratorio di Greg Rogers. Oggi vi mostreremo un procedimento per preparare cellule di Drosophila S due per la microscopia ottica.Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare la regolazione della duplicazione del centrosoma in Drosophila analizzando i cambiamenti nel numero e nella struttura dei centrosomi a seguito dell'eliminazione o della sovraespressione di importanti proteine regolatrici. Cominciamo dunque. Utilizziamo piastre di Petri standard da 35 millimetri per preparare le nostre piastre con fondo in vetro.Queste piastre con fondo in vetro mantengono le cellule in condizioni molto simili a quelle normali di coltura, consentendo al contempo l'osservazione di cellule vive attraverso vetro di qualità microscopica. Per l'assemblaggio delle piastre con fondo in vetro, si utilizza come superficie per la foratura un foglio di polistirolo con pareti spesse fissato con nastro adesivo. Posizionare la metà inferiore di una piastra di Petri da 35 millimetri sulla superficie di foratura, con la parte inferiore della piastra a contatto con il blocco di polistirolo, tenendo saldamente i lati della piastra; quindi utilizzare un trapano manuale con una punta a spatola da tre quarti di pollice per praticare un foro attraverso la piastra.Dopo aver forato tutti i vostri piatti, utilizzate una punta di trapano conica per molatura dotata di grana grossa e di un diametro pressoché uguale a quello della punta a spatola, per levigare il bordo esterno dei fori. Posizionate il trapano elettrico di lato, in modo che la punta sporga oltre il bordo del piano di lavoro. Tenete fermo il trapano posizionando un oggetto pesante ma malleabile sopra di esso, ad esempio un sacchetto di plastica resistente contenente 10 chilogrammi di sabbia.Utilizzare il pulsante di blocco per mantenere il trapano in funzione continua. Appiattire il bordo della propria piastra tenendolo e muovendolo contro la punta abrasiva, in modo da eliminare il bordo irregolare del nuovo foro. Una volta levigati i bordi esterni dei fori, inserire i fondi delle piastre in un grande becher e risciacquarli più volte con acqua distillata.Questo rimuoverà le piccole parti di plastica o polistirolo allentate, che successivamente galleggeranno. Disporre i fondi delle capsule ad asciugare. Quando le capsule saranno asciutte, preparare la colla Sard 180 4.Mescolare la resina e l'agente indurente in un rapporto ponderale di 10 a 1 e agitare accuratamente. Applicare un piccolo cerchio di colla attorno al foro praticato sulla superficie esterna di ogni piastra. Successivamente, posizionare un vetrino coprioggetto sul foro a contatto con la colla.Il vetrino deve essere grande almeno circa un millimetro più del foro presente nella piastra di Petri e più piccolo del diametro della piastra. Il vetrino deve adagiarsi sulla piastra in modo liscio e uniforme. A questo punto, mettere da parte le piastre.Lato inferiore, fino a completa essiccazione. Questo processo può richiedere un giorno o più a temperatura ambiente, ma è possibile accelerare la polimerizzazione ponendo le piastre in un incubatore caldo. Una volta che le piastre sono secche, possono essere rivestite con la lectina con A o con A. Utilizziamo la con A perché le due cellule che aderiscono a coprioggetti rivestiti con con A si appiattiscono notevolmente, diventando ottimi campioni per la microscopia.Per rivestire un piatto con un rivestimento, stendere 10 microlitri di soluzione di conne sulla faccia superiore del vetro di un piatto con fondo in vetro. Dopo l'essiccazione, sterilizzare il piatto e il suo coperchio con luce UV. In una cappa a flusso laminare per colture cellulari, posizionare i pezzi in modo che le loro superfici interne siano direttamente esposte alla lampada UV e accendere la luce sterilizzante UV per almeno 45 minuti.Due cellule S possono essere coltivate in diversi mezzi. Per i nostri scopi, utilizziamo il mezzo VITROGEN SF 902. Per preparare le cellule S trattate con RNAi per la microscopia, risospendere delicatamente le cellule e trasferirle in una capsula di vetro con fondo rivestito di conne contenente due millilitri di mezzo. Le cellule sane che entrano in contatto con il vetrino rivestito di conne aderiranno saldamente ad esso e inizieranno a espandersi.Questo processo dovrebbe risultare evidente già dopo circa 15 minuti e dovrebbe completarsi tra i 45 minuti e l'ora. Poiché le cellule S due possono essere facilmente mantenute in condizioni normali di temperatura e atmosfera da laboratorio, non sono necessarie condizioni o attrezzature speciali quando le cellule si trovano sotto il microscopio per prevenire la disidratazione; mantenere un quantitativo sufficiente di mezzo nel piatto posto sul microscopio. È possibile effettuare l'acquisizione di immagini in tempo reale di cellule S due per periodi prolungati.La durata di questi esperimenti è limitata soltanto dai comuni problemi di fotodegradazione e fototossicità. Le due cellule S possono essere fissate su una piastra con fondo in vetro o su un semplice coprioggetto. Tuttavia, in questo video illustreremo la fissazione e l'immunomarcatura in una piastra con fondo in vetro.Metanolo e formaldeide sono due fissativi comuni per cellule S. Per la fissazione cellulare con metanolo, raffreddare prima circa 300 millilitri di metanolo anidro in un becher di vetro da un litro coperto, all'interno di un congelatore a prova di esplosione a meno 20 gradi Celsius. Quando il metanolo è freddo, rimuoverlo dal congelatore. Rimuovere rapidamente il mezzo dal piatto con fondo in vetro e quindi immergere rapidamente il piatto nel metanolo.Rimettere rapidamente il becher contenente la piastra nel congelatore e fissare le cellule per 10-15 minuti. Dopo 10-15 minuti, rimuovere la piastra dal becher, versare via il metanolo residuo e reidratare le cellule. Aggiungendo PBST, le cellule sono ora pronte per le normali procedure di colorazione, come verrà dimostrato successivamente per la fissazione cellulare.Con il formaldeide, utilizziamo formaldeide al 10% in tampone. Questa concentrazione relativamente elevata di formaldeide è necessaria perché le cellule S2 non possiedono filamenti intermedi citoplasmatici, che altrimenti contribuirebbero a mantenere la morfologia e l'organizzazione cellulare durante il processo di fissazione. Fissare le cellule in formaldeide al 10% per 10-15 minuti.Al termine della fissazione, versare il formaldeide in un becher per rifiuti e lavare le cellule fissate con tre lavaggi brevi di PBST. Iniziare la procedura di immunomarcatura aggiungendo un millilitro di soluzione bloccante alle cellule fissate per 15 minuti. Utilizziamo abitualmente siero di capra normale al 5% in PBST.Versare la soluzione di blocco e aggiungere direttamente l'anticorpo primario sulle cellule. Rimettere il coperchio della piastra sulla capsula per evitare l'evaporazione della soluzione anticorpale e lasciare incubare l'anticorpo con le cellule per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo 30 minuti, rimuovere la soluzione dell'anticorpo primario.Utilizzare una pipetta Pasteur per aggiungere due millilitri di PBST nella piastra e attendere cinque minuti prima di sostituire il PBST. Eseguire quindi tre lavaggi con PBST. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 100 microlitri di anticorpo secondario direttamente sulle cellule.Rimettere il coperchio della piastra di Petri e lasciare che l'anticorpo incubi con le cellule per 30 minuti a temperatura ambiente. Trascorsi i 30 minuti, rimuovere l'anticorpo secondario ed eseguire tre lavaggi di cinque minuti ciascuno con PBST.Infine, aggiungere alcune gocce di mezzo di montaggio direttamente sulle cellule. Riposizionare il coperchio della piastra di Petri e, se necessario, conservare la piastra a quattro gradi Celsius al buio. Qui sono mostrate immagini rappresentative in contrasto di fase di cellule S2 dopo la semina su una piastra con fondo in vetro rivestito, dove i numeri indicano i minuti trascorsi dal momento della semina.L'appiattimento autonomo è evidente entro 15 minuti ed è essenzialmente completo entro 60 minuti. Si noti che le cellule diventano scure in fase man mano che si appiattiscono sul coverslip rivestito. In questa immagine ingrandita di cellule aderenti, i margini estesi e appiattiti indicati dalla testa di freccia sono chiaramente visibili.Due cellule possono essere trasfettate per esprimere proteine marcate con fluorofori che evidenziano strutture di interesse in cellule fisse o vive. In questo esempio, le cellule S2 sono state transettate in modo transitorio con un costrutto di fusione costituito da nucleofoina, un marcatore del nucleo, fuso al fluoroforo EGFP. Queste cellule sono state seminate in una piastra con fondo in vetro ricoperto di connessina e successivamente analizzate mediante microscopia a contrasto di fase (DIC) e microscopia in epifluorescenza.Le cellule S2 trattate con RNAi possono anche essere fissate e analizzate mediante immunofluorescenza. Queste immagini mostrano cellule S2 fissate, immuno marcate per il marcatore centrale PLP mostrato in verde e per i microtubuli mostrati in rosso, nonché colorate con DAPI per i cromosomi mostrati in blu. Prima della fissazione e dell'immunomarcatura, le cellule sono state sottoposte a un trattamento di quattro giorni con RNAi di controllo oppure con RNAi per l'abbattimento della proteina NCDA KINESIN, che promuove il concentramento dei poli dello fuso.Il trattamento con RNAi contro NCD ha prodotto cellule con poli dello spindolo divaricati e spindoli disorganizzati. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di essere molto cauti durante la foratura dei fori nelle piastre di coltura. Ecco tutto.Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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