Name: Drug Delivery sistemica e locale per la cura delle malattie del Sistema Nervoso Centrale in modelli di roditori (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-16T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Scopri quattro metodi di somministrazione farmacologica nel SNC di modelli murini: iniezione endovenosa, intraperitoneale, gavaggio orale e CED locale. Queste tecniche permettono di valutare l'efficacia terapeutica preclinica con imaging in vivo.

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NS65819 (CDJ, TO), NS049720 (CDJ), CA097257 (CDJ, TO), CIRM DR1-01426 Vorremmo ringraziare Raquel Santos per assistenza tecnica.

1. Metodi di consegna sistemica Anche se la consegna di farmaci sistemici non è l'approccio più efficiente per raggiungere elevate concentrazioni del farmaco nel sistema nervoso centrale, le consegne sistemici sono comodi e ben accettato dai pazienti. Qui dimostreremo procedure corrette per tre approcci sistemici solitamente usata somministrazione: iniezione endovenosa, iniezione intraperitoneale, e sonda gastrica. A. iniezione per via endovenosa (Vein iniezione di coda) <ol><li> Prima di iniziare la procedura, il peso corporeo di ogni mouse deve essere registrato. Come per tutti gli studi preclinici, il peso corporeo devono essere controllati regolarmente (due volte alla settimana o più) per valutare la potenziale tossicità dei farmaci. Non oltre l'1% del peso corporeo del mouse in volume dovrebbe essere iniettato in una sola volta. Per esempio, non più di 0,2 ml di liquido deve essere iniettato in un topo 20g. Tutti i fluidi iniettati per via endovenosa deve essere sterilizzati con un metodo appropriato. </li><li> Il mouse deve essere portata per 5-10 minuti utilizzando una piastra elettrica o una lampada di calore per dilatare la vena della coda. Se si utilizza una lampada di calore, monitorare il mouse in qualsiasi momento per evitare l'ipertermia. </li><li> Il mouse è trasferito ad un dispositivo di ritenuta, che trattiene il mouse, consentendo l'accesso alla vena della coda (vedi video). Nella coda di topo ci sono quattro vasi visibili: i vasi sui lati dorsale e laterali sono le vene, e la nave sul lato ventrale è un'arteria. Per accedere alla vena della coda, la coda del topo si tiene presso il punto più distale, e ruotato di 90 gradi in modo che la vena è rivolto verso l'alto. Il sito di iniezione viene pulito con un batuffolo di cotone imbevuto di alcool e una siringa da insulina 28g viene inserito, lato smussato alto, nella vena (vedi video). Se l'ago è correttamente posizionato nella vena, dovrebbe muoversi liberamente e senza pressioni. Iniettare lentamente il farmaco con una pressione uniforme sul 5-10 secondi. Se una bolla appare sulla coda, stop iniezione in quanto questo indica che l'ago non è più in vena. </li><li> Dopo l'iniezione, applicare una leggera pressione al sito di iniezione fino a quando l'emorragia si ferma. Questa operazione richiede normalmente 30-60 secondi. Monitorare il mouse per 5-10 minuti dopo l'iniezione per assicurarsi che non ci sono ulteriori emorragie. </li></ol> B. iniezione intraperitoneale <ol><li> Prima di iniziare l'iniezione, il farmaco deve essere caricato in una siringa collegata ad un ago 28g. Assicurarsi che ci sia spazio nella siringa per il disegno indietro il pistone prima dell'iniezione (ad esempio, se l'iniezione 200μL, assicurarsi che la capacità siringa è 300μL o superiore). </li><li> Rimuovere il mouse dalla gabbia per la coda e collocarla su una superficie strutturata, in modo che il mouse ha qualcosa da presa. Un coperchio gabbia di solito è sufficiente. Lasciare che il mouse per allungare il suo corpo e poi usare i tuoi mano non dominante, afferrare la pelle sul dorso del mouse, avendo cura di pizzicare leggermente la pelle il più possibile tra il pollice e indice e il medio (vedi video). Girare il mouse in modo che l'addome del mouse è rivolto verso l'alto. Se il mouse può liberamente muovere la testa, rilasciare la presa e riprovare, in modo da evitare di essere morsi durante l'iniezione. </li><li> Con la mano dominante, prendere la siringa ed inserire l'ago con un angolo di 30 gradi nel quadrante in basso a sinistra del mouse (vedi video). Tenendo il mouse leggermente invertita aiuterà spostare gli organi di distanza dal sito di iniezione. Per assicurarsi che l'ago sia nello spazio intraperitoneale, tirare indietro lo stantuffo della siringa. Se qualsiasi liquido o sangue appare nella siringa, poi l'ago non è nello spazio intraperitoneale e deve essere rimosso. Se non fluido è aspirato nella siringa, iniettare il contenuto della siringa con una pressione uniforme sul 1-5 secondi e rilasciare il mouse. </li><li> Monitorare il mouse per 5-10 minuti dopo l'iniezione per assicurare che il mouse ritorna a livelli normali attività. </li></ol> C. orale Gavage <ol><li> Prima di iniziare l'iniezione, registrare il peso del mouse. Il volume massimo che può essere consegnato mediante sonda gastrica è 10 ml per chilogrammo di peso corporeo. Per esempio, il volume massimo di un mouse 20g sarebbe 200μL. Tentare di iniettare maggiori volumi può causare reflusso, che causerà consegna incompleta droga. Se è necessario somministrare maggiori volumi rispetto a quello sopra, fino a tre dosi possono essere somministrate in 24 ore. </li><li> Per evitare la puntura del esofago, è importante misurare la lunghezza dell'ago sonda gastrica per ogni mouse. In possesso di una punta 18g palla ago curvo sonda gastrica al livello dell'ultima costola del mouse, e segnare la lunghezza alla punta della testa del mouse utilizzando un pennarello indelebile (vedi video). Durante la sonda gastrica, questo marchio sarà un punto di sosta quando si inserisce l'ago nella bocca del mouse. </li><li> Trattenere il mouse utilizzando la stessa presa per mano come un'iniezione intraperitoneale. Inserire l'ago sonda gastrica in bocca, sulla lingua, e ADVAUna volta che l'ago attraverso la faringe. Non inserire l'ago passato il segno di fermarsi. L'ago dovrebbe procedere senza intoppi, senza alcuna pressione (vedi video). Se si verificano pressioni, stop e togliere l'ago per evitare l'iniezione di liquido nei polmoni. </li><li> Con l'ago in posizione, spingere il pistone in 1-5 secondi e quindi rimuovere l'ago lo stesso angolo che è stato inserito. Monitorare il mouse per 5-10 minuti, prestando attenzione a eventuali segni di respiro affannoso che potrebbe indicare che il liquido è entrato nei polmoni. </li></ol> 2. Consegna locali Acuta convezione-Enhanced consegna A. Sonda Costruzione Un reflusso resistente cannula CED per i roditori non è ancora disponibile in commercio. Qui si dimostrerà un metodo per la costruzione cannula che è stata adattata da un primo metodo descritto da Krauze et al (Krauze 2005). <ul><li> La cannula ha tre parti (figura 1): 100um tubo di silice di diametro attraverso il quale i flussi infusate, un ago metallico rigido per il supporto strutturale, e tubi flessibili in teflon per il caricamento del infusate. </li><li> Per ottenere l'asta rigida di metallo, usare fiamme libere per fondere la plastica su un catetere Surflo IV (24g stiletto) e con delle pinzette rimuovere l'ago metallico. Il resto del catetere può essere scartata. Tagliare un pezzo di tubo di silice (OD 0,163 millimetri), leggermente più lungo che l'ago metallico, utilizzando un singolo filo della lama di rasoio. Ruolo il tubo di silice in una piccola goccia di cianoacrilato base ad azione rapida adesivo (ad esempio Krazy Glue), avendo cura di non avere la colla sulle estremità del tubo. Inserire il tubo di silice nella ago di metallo e lasciare asciugare per 5 minuti. </li><li> Una volta asciutto, il tubo di silice devono essere saldamente apposta ago. Le estremità della silice deve essere tagliato in modo che sporge di 2 millimetri di silice tubo dal l'estremità appuntita dell'ago e 3mm di silice tubo sporge dalla fine piatta (vedi video). </li><li> Tagliare una sezione di tubo in Teflon 20 cm di lunghezza. Rotolo l'ago di metallo in una piccola goccia di adesivo, sempre facendo attenzione a non prendere la colla sulle estremità del tubo di silice in quanto ciò ostruire la cannula. Inserire l'ago nel tubo in Teflon ad una profondità di 1 cm. Lasciate asciugare per 1 minuto. Utilizzando una pistola per colla, applicare una goccia di colla a caldo al giunto tra l'ago metallico e il tubo in Teflon (vedi video). Assicurarsi che il comune è coperto su tutti i lati e lasciare asciugare per almeno 1 ora. Cannule possono essere effettuate fino a una settimana di anticipo e conservato a temperatura ambiente. </li></ul> B. Procedura di Infusione <ul><li> Per preparare l'area chirurgica, tutte le superfici devono essere irrorate con un disinfettante, come ad esempio una soluzione di clorexidina al 2%. Guanti chirurgici sterili dovrebbero essere indossati durante la procedura. Le superfici vengono poi coperti con drappi assorbente. Le seguenti forniture deve essere posto in zona chirurgica: <ul><li> Riscaldamento pad per mantenere la temperatura corporea del mouse </li><li> Due piccoli piatti Petri, uno contenente perossido di idrogeno al 3%, e uno contenente 2% di clorexidina </li><li> Garza sterile e cotone tamponi </li><li> Bisturi sterili monouso (Numero 21) </li><li> Aghi sterili 22g </li><li> Topo stereotassica telaio </li><li> Controllato tasso di pompa a siringa </li><li> Autoclave del mouse pelle cucitrice, graffette, e rimozione di base </li></ul></li><li> Per configurare la cannula CED, allegare una siringa 1 ml al tubo in Teflon utilizzando un set di adattatori siringa di plastica. La cannula deve essere applicata al telaio stereotassico in modo che sia perpendicolare alla superficie chirurgico (vedi video). Per disinfettare la cannula, riempire la siringa con 1 ml di etanolo al 70% e premere lo stantuffo per eseguire l'etanolo attraverso la cannula. Ripetere questo processo con una soluzione fisiologica sterile, e controllare eventuali perdite intorno alle articolazioni cannula. Per disinfettare la parte esterna della cannula, pulire delicatamente con etanolo al 70% pulire. </li><li> Riempire la cannula con soluzione salina sterile e poi tirare indietro siringa in modo che una piccola bolla d'aria è aspirata nella cannula. Questa bolla d'aria separerà le infusate dal salino nella cannula. Poi, backload tuo infusate (vedi video). Collegare la siringa alla pompa siringa e adescare la pompa con una breve esecuzione della cannula. </li><li> Sedare il mouse utilizzando un anestetico iniettato e preparare la pelle dal tampone più volte (per 5-10 secondi) con un pezzo di garza sterile immerso nella soluzione di clorexidina al 2%. Pomata oftalmica deve essere applicato il mouse per mantenere l'umidità adeguata durante la procedura. Usando un bisturi sterile, creare una incisione sagittale lungo il centro del cranio, lungo circa 1,5 centimetri (vedi video). La superficie del cranio è poi puliti con un tampone di cotone imbevuto di una soluzione di perossido di idrogeno al 3%. Fare attenzione per evitare di perossido di idrogeno agli occhi del mouse. Le linee di sutura del cranio dovrebbe essere evidente a questo punto: se non sono visibili, tampone delicatamente il cranio con un fresh batuffolo di cotone imbevuto di soluzione di perossido di idrogeno al 3%. </li><li> Identificare il bregma (Figura 2) e quindi misurare 2mm a destra e posteriore 1mm di questa struttura per individuare il sito di infusione. Utilizzando l'ago sterile 22g, delicatamente creare un foro nel cranio, a questo punto ruotando l'ago contro il cranio (vedi video). Evitare assolutamente di forzare l'ago verso il basso contro il cranio. </li><li> A questo punto, il mouse deve essere posizionato nel frame stereotassico e iniziare a ricevere anestesia per via inalatoria (vedi video). Somministrare l'anestetico ad un livello basso (1%), e monitorare attentamente il mouse per i cambiamenti nel tasso di respirazione, regolando di conseguenza l'anestetico. </li><li> Posizionare la cannula sopra il foro del cranio e quindi abbassare 3 mm sotto la superficie del cranio. Iniziare l'infusione, applicando le seguenti aliquote e le durate: <table border="0"><tbody><tr><td> 0,1 microlitri / min per 5 minuti </td><td rowspan="5"><img src="/files/ftp_upload/1992/1992tablefigure.png" alt="Volume totale 10 ul" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Totale Volume 10 ul"></td></tr><tr><td> 0,2 microlitri / min per 5 minuti </td></tr><tr><td> 0,5 microlitri / min per 5 minuti </td></tr><tr><td> 0,8 microlitri / min per 7,5 minuti </td></tr><tr><td> OFF per 1 minuto </td></tr></tbody></table></li><li> Al termine dell'infusione, rimuovere lentamente la cannula e tampone del cranio con perossido di idrogeno al 3%. Applicare la cera sterile osso al foro (vedi video). Utilizzando pinze, disegnare la pelle insieme il cranio e fiocco a chiudere. Buprenorfina deve essere somministrato per il post-operatorio del dolore. </li><li> Monitorare il mouse post-operatoria fino a quando non riprende conoscenza e di mobilità. A causa della lunghezza della procedura, può richiedere fino a un'ora per il mouse per riguadagnare piena attività. Durante questo tempo il luogo della gabbia del mouse su una piastra elettrica per evitare l'ipotermia, e non la casa del topo recupero con altri topi attivi. </li><li> Graffette pelle deve essere rimosso una settimana dopo l'intervento chirurgico. </li></ul> C. imaging in vivo Infusate fluorescenza marcato può essere ripreso in seguito alla somministrazione CED, e possono essere monitorati per i cambiamenti di intensità del segnale e posizione del segnale. In genere, è meglio aspettare 2-3 ore dopo l'infusione di immagine, in modo da consentire il mouse per recuperare l'infusione. <ul><li> Per l'anestesia durante l'imaging, usare un basso livello di un anestetico per via inalatoria. Posizionare il mouse, lato dorsale alto, in una stazione di imaging (ad esempio, IVIS Lumina, Caliper Life Sciences, Alameda, CA). Utilizzando un filtro impostazione appropriata per il fluoro, che viene esposta, acquisire un'immagine. Per CED, un infuso di successo dovrebbe mostrare maggior parte del materiale del cervello in prossimità del sito di infusione (Figura 3). </li></ul> 3. Rappresentante Risultati La mancanza di reazione avversa alla somministrazione della terapia è un importante indicatore di iniezione di successo. Per esempio, dopo l'iniezione coda vena ci dovrebbe essere nessun cambiamento di aspetto (ad esempio, dimensioni, colore) della coda. Una bolla o blister dopo l'iniezione coda vena indicherebbe sottocutanea, piuttosto che per via endovenosa, la consegna della terapia. Per iniezioni intraperitoneali, un urto sulla pelle o decolorazione dell'addome può indicare iniezione sottocutanea o danni alle strutture interne. In sonda gastrica, un mouse con respiro affannoso o tosse può indicare che il liquido è stato iniettato nei polmoni, invece che nello stomaco. Per CED, la funzione neurologica è importante per valutare la somministrazione di successo della terapia. Un mouse che sta esibendo convulsioni o emiparesi potrebbe aver ricevuto una infusione improprio. Se un infusate fluorescente viene utilizzato, imaging in vivo può essere applicato per la valutazione della efficacia dell'amministrazione (Figura 3). Se il infusate non è localizzata al sito di iniezione, l'infusione non ha avuto successo. <img src="/files/ftp_upload/1992/1992fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: Cannula CED e Chirurgiche Set-up. Gli elementi di base della convezione avanzata parto chirurgico set-up sono mostrati. Una pompa microinfusion (A) è collegato alla cannula di infusione (B, l'ingrandimento in alto). Una cornice stereotassica (C) viene utilizzato per posizionare la sonda. Questa immagine non comprendono il riscaldamento e le attrezzature anestetico utilizzato anche durante la procedura. <img src="/files/ftp_upload/1992/1992fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: Mouse linee di sutura Teschio. Il sito di infusione CED (stella rossa) può essere localizzato, individuando l'intersezione delle suture sagittali e coronali (il bregma) e poi misura due millimetri laterale e 1 millimetro posteriore del bregma. <img src="/files/ftp_upload/1992/1992fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3: Risultati Rappresentante CED di successo. Liposomes etichettati con un far-rosso colorante fluorescente sono state infuse nel cervello di topo da CED e ripreso sia in vivo ed ex vivo. Una infusione di successo mostra un segnale fluorescente localizzato al sito di infusione sia in vivo (A) ed ex vivo (B). Il segnale deve essere localizzata nell'emisfero infusa senza dispersione nell'emisfero controlaterale. <img src="/files/ftp_upload/1992/1992fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4: Immagine rappresentante del CED di successo nel tronco cerebrale di ratto. Liposomi fluorescenza-marcato infuse in tronco cerebrale di ratto. Nei ratti, per quanto 20μL può essere infusa. Lo spessore maggiore del cranio ratto e la profondità di iniezione precluso imaging in vivo, ma la posizione infusione corretta potrebbe essere verificato da ex-imaging in vivo del cervello sezionato.

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</ol>

Tutte le procedure dimostrato qui è stato approvato dal Institutional Animal Care UCSF e del Comitato Usa.

Valutazione preclinica dell&#39;efficacia di qualsiasi agente terapeutico deve tenere in considerazione le proprietà farmacologiche di un agente e il tessuto bersaglio di interesse. Mentre i metodi di somministrazione sistemica sono in generale più facile e meglio tollerato dai pazienti, la selettività della barriera emato-encefalica spesso necessita di consegna locale della terapia per il trattamento delle malattie del SNC. Qui, abbiamo dimostrato un metodo di consegna diretta al cervello: CED. Altre forme di consegna locale al cervello comprendono la somministrazione diretta al fluido cerebro-spinale, l&#39;iniezione in bolo intratumorale, e l&#39;iniezione ventricolare. Per questi metodi, diffusibilità di terapeutico è di fondamentale importanza, con scarsa diffusione limitando la regione di copertura a pochi millimetri dal sito di iniezione (Jain 1989, Bobo 1994). Al contrario, CED utilizza la pressione positiva per aumentare l&#39;area di distribuzione della droga (Bobo 1994), pur consentendo targeting terapeutico per specifiche strutture neuroanatomiche. Nel nostro laboratorio, abbiamo effettuato con successo CED nel tronco cerebrale e nel caudato putamen nei roditori (Figura 4). La capacità di condurre CED in modelli di roditori è diventato sempre più importante in associazione con crescente interesse a massimizzare l&#39;efficacia terapeutica nel trattamento di vari tipi di malattie del SNC. CED possono essere usati per fornire una varietà di agenti, tra cui proteine ​​purificate, le droghe piccola molecola, e virus (Gill 2003, Degen 2003, Szerlip 2007). La gamma di malattie che possono essere trattate con CED include tumori del sistema nervoso centrale (Yamashita 2007) così come le malattie neurodegenerative come il morbo di Parkinson (Gill 2003). Come la ricerca CED continua ad espandersi, la necessità di imaging in vivo di CED terapia somministrata è allo stesso modo in aumento. Mentre l&#39;immagine fluorescente dimostrato qui probabilmente non sarà visibile attraverso il teschio umano, utilizzando altri metodi di co-infusione di agenti di contrasto per risonanza magnetica (Dickinson 2008) stanno suscitando interesse per valutare l&#39;applicabilità per il monitoraggio sostanze infuse nei pazienti con malattia sistema nervoso centrale.

<table><tbody><tr><td>Clorhexidina al 2%</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9756995</td><td>Conosciuta anche come Nolvasan&amp;#8221;</td></tr><tr><td>Ago da 20g</td><td>BD Biosciences</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>Ago da 28g (con siringa)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-004-270</td><td>Conosciuta anche come siringa per insulina</td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno al 3%</td><td>Fisher Scientific</td><td>H312P-4</td><td>Conservare lontano dalla luce</td></tr><tr><td>Tamponi di cotone</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-100</td><td>Autoclavare prima dell'uso</td></tr><tr><td>Adesivo a base di cianoacrilato</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9592632</td><td>Conosciuto anche come Krazy Glue&amp;#8221;</td></tr><tr><td>Lame da bisturi monouso</td><td>Feather Safety Razor Co, Ltd.</td><td>2975</td><td>N. 21</td></tr><tr><td>Garza</td><td>Fisher Scientific</td><td>22028563</td><td>Autoclavare prima dell'uso</td></tr><tr><td>Pad riscaldante</td><td>Dunlap</td><td>HP950</td><td></td></tr><tr><td>Catetere endovenoso</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-841-20</td><td></td></tr><tr><td>Pompa per infusione</td><td>BASi</td><td>MD-1000, MD-1001</td><td></td></tr><tr><td>Software Living Image</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>Richiedere preventivo</td><td></td></tr><tr><td>Unguento oftalmico</td><td>Cardinal Health</td><td>1272830</td><td>Conosciuto anche come Akwa Tears&amp;#8221;</td></tr><tr><td>Adattatori per siringhe in plastica</td><td>Upchurch Scientific</td><td>P-604, P-200NX, P-215X, P-630</td><td>Adatto a siringhe con attacco Luer Lock</td></tr><tr><td>Tubazione in silice</td><td>Polymicro Technologies</td><td>2000020</td><td></td></tr><tr><td>Stapler per cute, punti metallici, rimuovitore</td><td>Stoelting Co.</td><td>59020</td><td></td></tr><tr><td>Stereotassia</td><td>Stoelting Co.</td><td>51725</td><td></td></tr><tr><td>Tubazione in teflon</td><td>Upchurch Scientific</td><td>1520</td><td></td></tr><tr><td>Xenogen Lumina</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>Richiedere preventivo</td><td></td></tr></tbody></table>

drug delivery sistemica e locale per la cura delle malattie del sistema nervoso centrale in modelli di roditori

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Approfondito test preclinici del sistema nervoso centrale (SNC) terapie include una considerazione di vie di somministrazione e di biodistribuzione agente nella valutazione dell&#39;efficacia terapeutica. Tra le due categorie principali di amministrazione, locale vs sistemica, gli approcci sistemici di consegna sono spesso preferiti a causa della facilità di somministrazione. Tuttavia, la consegna sistemica può determinare concentrazione del farmaco non ottimale stato raggiunto nel SNC, e condurre a conclusioni errate per quanto riguarda l&#39;efficacia degli agenti. Locali metodi di somministrazione dei farmaci sono più invasive, ma possono essere necessarie per raggiungere livelli terapeutici farmaco sistema nervoso centrale. In questo studio dimostriamo tecnica corretta per tre vie di somministrazione dei farmaci sistemici: iniezione endovenosa, iniezione intraperitoneale, e sonda gastrica. Inoltre, mostriamo un metodo per la consegna locale al cervello: convezione-enhanced consegna (CED). L&#39;uso di composti marcati con fluorescenza è incluso per imaging in vivo e la verifica della corretta somministrazione del farmaco. I metodi sono presentati utilizzando modelli murini, ma può essere facilmente adattato per l&#39;utilizzo nei ratti.

Approfondita sperimentazione preclinica di farmaci che agiscono nel sistema nervoso centrale spesso comporta la valutazione e il confronto biodistribuzione farmaco in associazione con percorsi specifici di somministrazione. Qui, tre metodi comunemente usati di consegna sistemica (per via endovenosa, intraperitoneale e orale), nonché un metodo per la consegna locale (convezione-enhanced consegna) sono dimostrati nei topi.

Drug Delivery sistemica e locale per la cura delle malattie del Sistema Nervoso Centrale in modelli di roditori

Una valutazione preclinica approfondita dei farmaci per il sistema nervoso centrale (SNC) include l'analisi delle vie di somministrazione e della biodistribuzione dell'agente...

In questo articolo video vengono dimostrati quattro metodi di somministrazione di farmaci al sistema nervoso centrale. I primi tre metodi sono iniezione endovenosa, iniezione intraperitoneale e gavaggio orale. Tutti e tre questi metodi determinano una somministrazione sistemica del farmaco.L'ultimo metodo consiste in un'infusione locale di farmaco nel cervello del topo. Per questo metodo, l'immagine ottica in vivo viene utilizzata per verificare un'infusione corretta. Le tre tecniche di somministrazione sistemica sono procedure standard ampiamente utilizzate in contesti preclinici.La tecnica di somministrazione locale è leggermente più complessa, ma consente la somministrazione diretta dell'agente al cervello, aggirando la barriera ematoencefalica. Questi metodi possono contribuire a rispondere a domande fondamentali nell'ambito della nuova oncologia, come l'efficacia e la distribuzione di terapie innovative, anche se tali approcci possono fornire informazioni utili per il trattamento innovativo dei tumori cerebrali.Questi metodi possono essere applicati anche ad altre malattie del sistema nervoso centrale, come i disturbi neurodegenerativi e psichiatrici. Utilizzare una lampada a infrarossi per dilatare la vena della coda riscaldando il topo per cinque-dieci minuti, monitorando attentamente l'animale in ogni momento per evitare ipotermia durante il riscaldamento. Caricare il farmaco in una siringa per insulina da 28 gauge.Non si deve iniettare un volume superiore all'1% del peso corporeo del topo in un'unica volta. Dopo che sono trascorsi da cinque a dieci minuti, per trasferire il topo in un dispositivo di contenimento dalla coda del topo, sono visibili quattro vasi.I vasi dorsali e laterali sono vene. Il vaso ventrale è un'arteria; per accedere alla vena laterale della coda, tenere la coda del mouse nel punto più distale e ruotarla di 90 gradi in modo che la vena sia rivolta verso l'alto. Pulire i siti di iniezione con un batuffolo di alcol.Successivamente, inserire la siringa preparata con la punta del bevel rivolta verso l'alto nella vena. Se l'ago è posizionato correttamente all'interno della vena, dovrebbe muoversi liberamente e senza resistenza. Iniettare lentamente il farmaco con una pressione costante nell'arco di cinque-dieci secondi.Se la coda diventa gonfia, interrompere l'iniezione poiché ciò indica che l'ago non è più all'interno della vena. Dopo l'iniezione, applicare una leggera pressione sul sito di iniezione fino a quando l'emorragia non si arresta. Questo normalmente richiede da 30 a 60 secondi.Monitorare il topo per cinque-dieci minuti per assicurarsi che non ci sia ulteriore sanguinamento. Prepararsi per questa procedura caricando una siringa con un ago da 28 gauge con il farmaco. Rimuovere il topo dalla gabbia tenendolo per la coda e posizionarlo su una superficie ruvida, come il coperchio di una gabbia, in modo che il topo abbia qualcosa a cui aggrapparsi.Permettere al topo di allungare il corpo. Successivamente, afferrare la pelle sulla schiena del topo avendo cura di pizzicare leggermente la maggior quantità possibile di pelle tra il pollice e le dita indice e media. Ruotare il topo in modo che l'addome sia rivolto verso l'alto.Se il topo può muovere liberamente la testa, rilasciare la presa e riprovare. Per evitare di essere morso durante l'iniezione, tenere il topo leggermente capovolto in modo da aiutare a spostare gli organi lontano dal sito di iniezione. Inserire l'ago della siringa preparata con un angolo di 30 gradi nel quadrante inferiore sinistro del topo per assicurarsi che l'ago si trovi nello spazio intraperitoneale.Ritirare lentamente lo stantuffo della siringa. Se nessun liquido viene aspirato nella siringa, iniettare il contenuto della siringa con una pressione costante per uno a cinque secondi. Rilasciare il mouse.Monitorare il topo per cinque-dieci minuti dopo l'iniezione per assicurarsi che ritorni a livelli normali di attività. Iniziare la gavaggio orale determinando fino a che punto l'ago può essere inserito nella bocca del topo. Tenere un ago curvo per gavaggio con punta a sfera da 18 G all'ultimo rene.Segnare la lunghezza utilizzando un pennarello indelebile. Pesare il topo per determinare il volume di iniezione. Il volume massimo somministrabile per sondino gastrico è di 10 millilitri per chilogrammo di peso corporeo.Quindi caricare l'ago. Successivamente, immobilizzare il topo utilizzando la stessa presa mostrata per l'iniezione intraperitoneale. Inserire l'ago della gavaggio in bocca oltre la lingua e avanzare l'ago attraverso la faringe per evitare di perforare l'esofago.Non inserire l'ago oltre il segno di arresto. L'ago deve avanzare senza alcuna resistenza. Con l'ago in posizione, premere lentamente lo stantuffo.Rimuovere l'ago allo stesso angolo con cui è stato inserito. Non tentare di iniettare volumi maggiori di quelli raccomandati, poiché ciò potrebbe causare reflusso e un'erogazione incompleta del farmaco.Rimettere il topo nella sua gabbia e monitorarlo per cinque-dieci minuti. Prestare particolare attenzione a eventuali segni di respiro difficoltoso, che potrebbero indicare un ingresso di liquido nei polmoni. Ripetere questa procedura secondo necessità.Possono essere somministrate fino a tre dosi in un periodo di 24 ore, poiché una cannula per CED resistente al reflusso per roditori non è ancora disponibile in commercio. Costruire una cannula composta da tre parti: un tratto di tubo di silice con diametro di 100 micron attraverso il quale fluisce l'infusato.Un ago metallico rigido per il supporto strutturale e un tubo flessibile in teflon per il caricamento dell'infusione. Per preparare l'area chirurgica, spruzzare tutte le superfici con disinfettante al clorhexidina al 2%. Quindi coprire le superfici con drappi assorbenti.I seguenti materiali devono essere posizionati nell'area chirurgica. Scegliere ulteriori piastre di Petri, una contenente perossido di idrogeno al 3% e una contenente clorhexidina al 2%, GRE sterili e bastoncini di cotone. Scalpelli sterili monouso numero 21, autoclave, stapler per cute di topo, punti metallici e dispositivo per la rimozione dei punti metallici.Aghi sterili da 20 gauge, un cuscinetto riscaldante per mantenere la temperatura corporea del topo, un telaio stereotassico per topo e una pompa per siringa a velocità controllata. Per preparare la cannula, collegare una siringa da un millilitro al tubo in teflon. Utilizzando un set di adattatori in plastica per siringhe, fissare la cannula al telaio stereotassico in modo che sia perpendicolare alla superficie chirurgica.Utilizzando una siringa da un millilitro, disinfettare la cannula facendo passare alcol al 70% al suo interno. Ripetere questa procedura utilizzando soluzione salina sterile. Successivamente, verificare la presenza di eventuali perdite intorno alle giunzioni della cannula.Estrarre lentamente lo stantuffo della siringa in modo da aspirare una piccola bolla d'aria nell'ago cannula. Questa bolla d'aria separerà l'infuse eight dalla soluzione fisiologica. Successivamente, caricare all'indietro l'infuse eight.Primi la pompa facendo scorrere brevemente la cannula. Sostituisci la cute di un topo anestetizzato con un batuffolo sterile imbevuto di clorhexidina al 2%, applica un unguento oftalmico per mantenere un'adeguata umidità oculare durante la procedura. Utilizzando un bisturi sterile, pratica un'incisione sagittale lungo il centro del cranio, lunga circa 1,5 centimetri.Pulire la superficie del cranio utilizzando un bastoncino di cotone imbevuto in una soluzione di perossido di idrogeno al 3%. A questo punto, le linee delle suture del cranio dovrebbero essere visibili. In caso contrario, passare delicatamente un bastoncino di cotone fresco imbevuto in soluzione di perossido di idrogeno al 3%.Individuare il bgma, quindi misurare due millimetri a destra e un millimetro in posizione posteriore per localizzare il sito di infusione. Utilizzando un ago sterile da 20 gauge, creare delicatamente un foro nel cranio in questo punto ruotando l'ago contro l'osso. Evitare di forzare l'ago verso il basso contro il cranio.A questo punto, trasferire il topo nel telaio stereotassico e iniziare a somministrare l'anestetico inalatorio a un livello basso. Monitorare attentamente il topo per rilevare variazioni della frequenza respiratoria, regolando di conseguenza l'anestetico.Quindi, questo passaggio successivo è probabilmente l'aspetto più difficile dell'intero metodo. Quando si posiziona la cannula, assicurarsi di centrarla esattamente sul foro. Per farlo, verificare il posizionamento della cannula da tutti gli angoli.Successivamente, posizionare la cannula sopra il foro nel cranio e abbassarla di tre millimetri al di sotto della superficie cranica. Iniziare l'infusione accendendo la pompa per siringa utilizzando le velocità e le durate indicate qui alla fine dell'infusione. Rimuovere lentamente la cannula e sciacquare il cranio con perossido di idrogeno al 3%.Applicare cera ossea sterile sul foro utilizzando pinzette. Avvicinare la pelle e chiudere con punti metallici. Somministrare buprenorfina per via sottocutanea per il sollievo dal dolore postoperatorio.Posizionare il topo in una gabbia su un tappetino riscaldante per evitare l'ipotermia. Non ospitare il topo in fase di recupero insieme ad altri topi attivi. Monitorare il topo nel periodo postoperatorio fino a quando non riprende coscienza e mobilità.A causa della lunghezza della procedura, potrebbero volerci fino a un'ora perché il topo riprenda piena attività. Se si eseguirà l'imaging, è preferibile attendere da due a tre ore prima di effettuare l'imaging dell'infusione marcata con fluorescenza. Otto. Dopo la somministrazione mediante CED, posizionare il topo anestetizzato con la parte dorsale rivolta verso l'alto in una stazione di imaging, utilizzando un'impostazione del filtro appropriata per la fluorescenza da visualizzare.Acquisire un'immagine per la CED. Un'infusione riuscita dovrebbe mostrare la maggior parte del materiale all'interno del cranio, vicino al sito di infusione. L'assenza di reazioni avverse alla somministrazione della terapia è un importante indicatore di iniezione riuscita.I seguenti sono indicatori di iniezioni inadeguate per iniezioni caudali: cambiamento nell'aspetto di dimensione o colore della coda, formazione di una bolla o vescica nella coda, che indica un'erogazione sottocutanea piuttosto che intravenosa. Per le iniezioni intraperitoneali, una protuberanza sulla pelle o una discolorazione dell'addome possono indicare un'iniezione sottocutanea o un danno alle strutture interne.Nella gavaggio orale, un topo con respiro affannoso o tosse potrebbe indicare che il liquido è stato iniettato nei polmoni anziché nello stomaco. Per la CED, la funzione neurologica è importante per valutare l'esito positivo della somministrazione della terapia. Un topo che presenta convulsioni o emiparesi potrebbe aver ricevuto un'infusione inadeguata.Qui l'immagine in vivo è stata eseguita su un topo con un'infusione CED riuscita mostrata a sinistra e un'infusione non riuscita mostrata a destra. Si noti che nell'infusione riuscita, il segnale di imaging è localizzato nel cervello, mentre nell'infusione non riuscita il segnale si è diffuso lungo l'asse neurale.Come hai visto, l'aspetto più complesso di questa procedura riguarda la corretta selezione della via di somministrazione. Quando si somministrano farmaci al sistema nervoso centrale, è importante considerare la proprietà farmacologica dei farmaci al fine di scegliere il miglior regime di somministrazione. Questo è tutto.Spero che questa presentazione ti sia stata utile e buona fortuna con i tuoi esperimenti.

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