Fotoconversione di proteine ​​purificate fluorescenti ed evidenziazione ottica dual-sonda in cellule vive

L'obiettivo generale del seguente esperimento è utilizzare le proteine fluorescenti M orange due e andron come sonde ottiche duali per etichettare in modo selettivo quattro popolazioni cellulari singole o compartimenti cellulari. Questo risultato si ottiene innanzitutto illuminando le cellule con una luce di eccitazione a bassa intensità a 488 nanometri per spegnere tutta la fluorescenza verde prodotta da green drawn. Come secondo passaggio, le cellule vengono esposte a una luce di eccitazione ad alta intensità a 488 nanometri, che fotoconverte la fluorescenza di m orange da arancione a rossa.

Successivamente, le cellule vengono esposte a un'eccitazione a due fotoni a 800 nanometri per attivare la fluorescenza di dral. Anche in questo caso, i risultati ottenuti dimostrano che è possibile etichettare le cellule in quattro combinazioni distinte basate sull'evidenziazione ottica con doppio sondeo mediante M Orange due e drawn ppa. Il principale vantaggio di questo procedimento rispetto agli esperimenti esistenti, come la frazionatura subcellulare, consiste nel fatto che viene eseguito su cellule vive.

Questa procedura può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella biologia delle cellule beta, ad esempio perché solo una piccola frazione delle vescicole di insulina viene secreta. Sebbene questa procedura possa fornire informazioni sul funzionamento delle cellule beta, può essere applicata anche ad altri sistemi. Ad esempio, al tracciamento delle cellule tumorali in vivo, un campione di goccioline di proteina fluorescente consiste in un'emulsione acquosa ottagonale con una proteina fluorescente presente nella fase acquosa.

Questa emulsione viene inserita tra un vetrino da microscopio e un coprioggetto quadrato da 22 millimetri per applicazioni di microscopia. All'inizio di questa procedura, i vetrini e i coprioggetti devono essere puliti e rivestiti con un agente idrofobo. Pulire il materiale in vetro lavandolo per cinque minuti con acetone.

Dopo il lavaggio, lasciare asciugare l'apparecchiatura di vetro all'aria. Successivamente, preparare una soluzione al 2% di metiltrimetossisilano in acetone e ricoprire l'apparecchiatura di vetro con la soluzione per due minuti. Dopo la ricopertura, rimuovere l'apparecchiatura di vetro dalla soluzione e lasciarla asciugare.

Quindi risciacquare la vetreria con etanolo al 70% da un flacone spray. Dopo il risciacquo, lasciare asciugare la vetreria all'aria e rimuovere qualsiasi liquido residuo. Utilizzando aria compressa, la vetreria rivestita può essere conservata per almeno un mese.

Dopo aver preparato la vetreria, ottenere le proteine fluorescenti precedentemente purificate come proteina con tag his da e coli. Misurare lo spettro di assorbimento della proteina purificata. Preparare una diluizione stock con una densità ottica di circa 0,1 in soluzione di salina tamponata al tris con pH otto contenente lo 0,1% di albumina sierica bovina.

Inoltre, preparare 10 millilitri di una miscela uno a uno di ottile e soluzione salina tampone al tris in un tubo conico da 15 millilitri e mescolare vigorosamente. Dopo il mescolamento, lasciare riposare la miscela fino al completamento della separazione delle fasi. La fase superiore è l'ottile; per preparare l'emulsione, pipettare 45 microlitri di ottile e 5 microlitri di proteina fluorescente in un tubo epi o in un tubo orf.

Battere leggermente il tubo alcune volte per avviare la formazione dell'emulsione, quindi sottoporre il tubo a sonificazione per 30 secondi in un bagno a ultrasuoni. Nel frattempo, preparare una lametta microscopica rivestita e un vetrino coprioggetto subito dopo la sonificazione. L'emulsione deve risultare completamente opaca.

Trasferire immediatamente quattro microlitri dell'emulsione dalla parte centrale del tubo su un vetrino microscopico rivestito e coprirlo con un'ampolla rivestita. L'emulsione deve distribuirsi uniformemente tra il vetrino e l'ampolla. Entro pochi minuti, il campione dovrebbe stabilizzarsi.

La seguente procedura rappresenta una strategia generale per impostare un esperimento di fotoconversione di una proteina fluorescente su un microscopio confocale a scansione laser. Questa procedura può essere applicata sia a proteine purificate che a cellule vive. In questo esperimento, un campione in forma di goccia contenente la proteina purificata m orange two viene utilizzato come punto di partenza generale per l'esperimento di fotoconversione.

Impostare il microscopio a scansione laser confocale come segue. Utilizzare un obiettivo a immersione in olio da 40 x 1,3 di apertura numerica e una dimensione dell'immagine di 512 per 512 pixel. Impostare il tempo di permanenza del pixel a sei microsecondi, lo zoom a quattro e aumentare la dimensione del pinhole in modo da ottenere una risoluzione Z di tre micron.

Configurare due canali di rilevamento per la fluorescenza iniziale e quella fotoconvertita, oltre a un canale di fotoconversione. Osservare le specie arancioni utilizzando una luce di eccitazione a 561 nanometri e raccogliere la fluorescenza tra 570 e 630 nanometri. Rilevare le specie rosse fotoconvertite utilizzando una luce di eccitazione a 633 nanometri e raccogliere la fluorescenza tra 640 e 700 nanometri.

Per il canale di conversione fotochimica, selezionare la linea laser a 488 nanometri e raccogliere la fluorescenza tra 490 e 540 nanometri. Imaging. Il canale di conversione fotochimica non è strettamente necessario, ma può essere utile. Per iniziare l'esperimento, utilizzare il canale del rivelatore per acquisire la fluorescenza iniziale con scansione continua, regolando la potenza del laser e il guadagno del rivelatore per ottenere una qualità ottimale dell'immagine.

Quindi attivare il canale di conversione fotoindotta e selezionare una bassa potenza laser. Iniziare l'acquisizione di una serie a intervalli e aumentare gradualmente il laser di conversione fotoindotta fino a quando non si osserva un significativo sbiancamento della fluorescenza iniziale. Continuare la scansione fino a quando la fluorescenza iniziale non risulti sbiancata approssimativamente al 75%.

Successivamente, disattivare il canale di conversione fotochimica e attivare il canale di rilevamento per la fluorescenza fotoconvertita. Iniziare l'acquisizione con un guadagno del rilevatore alto e una bassa potenza del laser. Aumentare quindi gradualmente la potenza del laser fino a quando non viene rilevata la fluorescenza fotoconvertita.

Dopo aver rilevato il segnale, regolare la potenza del laser e la rilevazione o il guadagno per ottenere una qualità ottimale dell'immagine. Infine, ottimizzare la potenza del laser utilizzata per la fotoconversione e la sua durata. Aumentare la potenza del laser accelererà la velocità di fotoconversione.

Tuttavia, una potenza laser eccessiva provocherà il fotoblecimento della proteina. Una volta determinate la fotoconversione ottimale, la potenza e la durata del laser, questi parametri possono essere utilizzati per configurare un modulo standard di fotoblecimento o un modulo di recupero della fluorescenza dopo fotoblecimento. A quel punto, il canale di fotoconversione non sarà più necessario a causa delle proprietà spettrali di Redshift di M orange due.

È possibile utilizzarlo in combinazione con la proteina fluorescente fotoattivabile verde disegnata PU per l'evidenziazione ottica con doppio sonda. Per iniziare l'evidenziazione ottica con doppia sonda, coltivare cellule HeLa in piatti con fondo in vetro. Incubare le cellule con plasmidi che codificano per le proteine fluorescenti 24 ore prima dell'acquisizione delle immagini, utilizzando una trasfezione standard con LIPECTOMY 2000.

Posizionare le cellule vive su un microscopio confocale a scansione laser e configurare il microscopio per la conversione fotochimica di M orange a due fotoni come descritto in precedenza. Successivamente, configurare il microscopio per l'interruttore fotochimico di DPA. DPA viene eccitato con luce a 488 nanometri e la sua fluorescenza può essere immaginata utilizzando il canale di conversione fotochimica a due fotoni di M orange.

Assicurarsi di minimizzare la potenza del laser utilizzata per l'acquisizione delle immagini di MPA, poiché un'eccessiva potenza del laser provocherà l'inattivazione di mpa. Aggiungere un canale per l'attivazione fotochimica di MPA mediante eccitazione a due fotoni a 800 nanometri, quindi determinare la potenza del laser necessaria per l'acquisizione delle immagini, l'attivazione fotochimica e l'inattivazione fotochimica della fluorescenza di OFA.

Uno degli aspetti più difficili di questa procedura consiste nell'inattivare la RPA senza fotoconvertire M orange, poiché entrambi gli eventi avvengono alla stessa lunghezza d'onda. Per evitare ciò, è molto importante ottimizzare attentamente la fotoconversione.

Potenza e durata del laser Prestare attenzione alla fotoconversione di M orange due. Un'inattivazione di PU si verifica entrambe le volte durante l'eccitazione con luce a 488 nanometri, inattivando PU senza una fotoconversione significativa di M orange due. Utilizzare una potenza laser più bassa una volta impostati i parametri per la fotoconversione di M orange due e l'interruttore fotochimico del DPA.

È possibile ottenere una marcatura ottica con doppio sonda. Innanzitutto, inattivare la fluorescenza della DPA in tutto il campo visivo mediante eccitazione a bassa potenza a 488 nanometri. Successivamente, selezionare una regione di interesse e convertire mOrange2 mediante eccitazione ad alta potenza a 488 nanometri.

Infine, selezionare una regione di interesse e attivare la fluorescenza del DPA mediante eccitazione a due fotoni a 800 nanometri. I campioni di goccioline di proteine fluorescenti sono particolarmente adatti per configurare applicazioni di fotoconversione al microscopio confocale. Quando il campione di goccioline viene preparato correttamente, le goccioline appaiono molto omogenee.

Tuttavia, quando il campione viene preparato senza rivestire il vetrino del microscopio con un coprioggetto, le goccioline tendono ad essere schiacciate contro una delle superfici di vetro nei campioni preparati. In assenza di BSA allo 0,1%, la proteina fluorescente tende ad accumularsi all'interfaccia ottano-acqua. La formazione di un alone di fluorescenza dovuta alla fotoconversione dipende criticamente dalla potenza del laser e dalla durata dell'esposizione.

Un'eccessiva potenza del laser o un'esposizione troppo prolungata causeranno fotobiancamento e porteranno a una riduzione della fluorescenza rossa fotoconvertita. Le distinte proprietà spettrali di M orange due e PHO permettono un'evidenziazione ottica doppia prima della fotoconversione: le cellule che esprimono M orange due, istone H due B e DPA mito mostrano fluorescenza arancione nel nucleo e fluorescenza verde nei mitocondri. Quando tutta la fluorescenza viene spenta mediante eccitazione a bassa potenza a 488 nanometri, si verifica una fotoconversione minima di M orange.

Due M arancione due possono quindi essere fotoconvertiti in rosso mediante eccitazione a 488 nanometri ad alta potenza. Una volta che M arancione due è stato fotoconvertito, la fluorescenza del puff disegnato può essere riattivata utilizzando eccitazione a due fotoni a 800 nanometri. Con l'evidenziazione ottica a doppio sonda, le cellule possono essere etichettate in quattro modi distinti.

Utilizzando questa tecnica, è possibile etichettare in modo specifico quattro diverse popolazioni cellulari. Come hai visto, uno degli aspetti più difficili di questa procedura è inattivare MPA senza fotoconvertire mOrange. Una volta padroneggiata, è possibile eseguire ulteriori esperimenti utilizzando questo sistema, ad esempio tracciare più popolazioni in cellule beta pancreatiche.

Ecco fatto. Spero che questa presentazione ti sia stata utile e buona fortuna con i tuoi esperimenti.