Name: Culture primarie neuronale dal cervello di tardo fase Drosophila Pupae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 12 s
Description: Scopri la preparazione di culture neuronali primarie dal cervello di pupae tardive di Drosophila. Questo metodo consente di studiare lo sviluppo neuronale e l'attività calcica in vitro.

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Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere NS27501 a DKOD. Supporto aggiuntivo per questo lavoro è stato fornito da una concessione di UC Irvine a sostegno della DKOD attraverso il Programma Professore HHMI.

I preparativi prima del giorno di coltura: <ol><li> Fai la soluzione sterile dissezione. </li><li> Rendere sterile DMEM e mantenere in aliquote da 10 ml a 4 ° C per 2 settimane. </li><li> Rendere sterile DDM2 integratori e congelare in 50 o aliquote di 100 microlitri per 1 mese. </li><li> Fai ConA / laminina. </li><li> Cappotto coprioggetto. Opzionale: Fai CNBM sterile e conservare congelati per un massimo di 4 mesi. </li></ol> Il giorno di coltura I. Preparare soluzione enzimatica (ES) in cappa a flusso laminare <ol><li> Mettere 5 ml di soluzione di dissezione (DS) in una provetta da centrifuga da 15 ml. </li><li> Pesare 0,8 mg di L-cisteina in una Eppendorf 0,6 ml e aggiungere 150 ml di DS. Pipetta su e giù fino cristalli sono andati. </li><li> Aggiungere 150 ml di DS / Cisteina ai 5 ml DS e mescolare bene. </li><li> Aggiungere 50 U (unità) di papaina. </li><li> Aggiungere 7 ml di 0,1 N Na OH e mescolare bene. Soluzione sarà chiara entro 30 min. quando viene attivato. </li><li> Enzima soluzione filtro con filtro da 0,2 millimetri in una siringa sterile tubo a vite microcentrifuga 1,5 ml tappo Papaina: Volete 50 U in 5 ml DS. Ogni lotto è leggermente diverso, così bisogna calcolare quanto: 37,3 mg / ml e 28,3 U / mg 37,3 x 28,3 = 1055,59 U / ml (1000 ml) 50 U = 47,4 ml </li></ol> II. Fai DDM2 dei media Del giorno di coltura: aggiungere i seguenti supplementi per rendere DDM2 A 10 ml di DMEM aggiungere supplementi, poco prima di coltura: <ol><li> 100μl transferrina </li><li> 100μl Putrescine </li><li> 100μl Selenio </li><li> Progesterone 100μl </li><li> L&#39;insulina 50μl </li><li> 10μl 20-hydroxyecdysone </li></ol> Nota: abbastanza DDM2 per tutte le culture pianificata (ogni cervello placcato su un unico vetrino in una teglia da 35 millimetri individuale Petri, 1,5 ms di media / cultura) Fase III-VI può essere a una panchina fatta di laboratorio non sterili e dovrebbe essere completato in 45 minuti o meno. III. Pupe Collection <ol><li> Seleziona 10-15 pupe da più parti di fiala sotto un microscopio da dissezione. </li><li> Pupe posto nel coperchio di un piatto mm secco 35 Petri. </li></ol> Nota: In genere uso il cervello da pupe tra 55-78 ore dopo la formazione puparium (APF). E &#39;leggermente più difficile da sezionare il cervello dalle pupe più giovani dato che le capsule testa tendono a collassare, mentre il livello globale della crescita dei neuriti è leggermente inferiore dal più antiche pupe. Nel Canton-S ceppo tipo selvatico, queste fasi sono riconosciuti da occhi pigmentati che sono marrone chiaro al rossiccio leggermente, con poco pigmento altrove. IV. Decapitazione sotto microscopio da dissezione <ol><li> Mettere due gocce di soluzione sterile dissezione nel coperchio della piastra Petri, vicino a pupe. </li><li> Premere delicatamente una sola pupa con una pinza sottile nella mano sinistra e utilizzare un 27 ago della siringa attaccato ad una siringa da 1 cc nella mano destra per rimuovere la cuticola alla fine anteriore della pupa. </li><li> Spremere pupa leggermente con una pinza e come capo emerge utilizzare i 27 gauge a tagliare il collo. </li><li> Con la punta di un ago o la pinza, il trasferimento testa a goccia di dissezione soluzione. </li><li> Ripetere fino ad avere 10-15 teste in una sola goccia. </li></ol> Rimozione V. del cervello dalla testa sotto microscopio da dissezione <ol><li> In ogni mano mantenere una siringa da 1 cc con un ago da 27 gauge. </li><li> Usare questi per posizionare la testa vola nella goccia di soluzione in modo da sezionare la proboscide è rivolto verso l&#39;alto e la superficie dorsale della testa è a nord. </li><li> Inserire l&#39;ago a sinistra nella proboscide al pin la testa in giù e utilizzare l&#39;ago diritto di presentare una fessura nell&#39;occhio destro che va dal ventrale verso la superficie dorsale. </li><li> Inserire l&#39;ago proprio vicino alla sinistra nella regione della proboscide e quindi utilizzare l&#39;ago a sinistra per premere delicatamente la cuticola sopra l&#39;occhio sinistro, spingendo il cervello verso la fessura nell&#39;occhio destro. Il cervello deve uscire dalla fessura a destra, relativamente intatte, spesso con entrambe le ottiche lobes ancora attaccato e talvolta il tessuto oculare pigmentato pure. </li><li> Spingere il cervello sul retro del l&#39;ago e trasferire a una goccia di soluzione salina sterile dissezione in una nuova sterile, 35 millimetri piatto di Petri. </li><li> Raccogliere 10-15 cervelli per ogni genotipo. </li></ol> VI. Rimozione dei lobi ottici e trattamento enzimatico <ol><li> In ogni mano mantenere una siringa da 1 cc con un ago da 27 gauge e utilizzare questi per raccogliere tutti i cervelli in una piccola area della goccia di soluzione di dissezione </li><li> Utilizzare siringhe, utensili da taglio per rimuovere i lobi ottici da ogni cervello in modo che il tessuto rimanente per la cultura è la regione centrale del cervello. </li><li> Usare un 20 l Pipetman, fissato al 5 microlitri, per trasferire tutti i cervelli di un singolo genotipo di una provetta Eppendorf contenente 1 ml di soluzione di papaina sterile. </li><li> Cervelli incubati in papaina per 10-15 minuti su un insieme dei rotatori a 60 giri. </li><li> Centrifugare a 3000 rpm per 3 minuti. </li></ol> All&#39;interno cappa sterile a flusso laminare - tutte le fasi in cui è esposto il tessuto all&#39;aria dovrebbe essere fatto in cappa a flusso laminare per i passaggi rimanenti. VII. Lavaggio <ol><li> Rimuovere soluzione enzimatica e sostituire con soluzione sterile dissezione. </li><li> Centrifugare a 3000 rpm per 3 minuti. </li><li> Lavare con soluzione sterile dissezione per un totale di 3 volte. </li><li> Rimuovere salina sezionare e sostituire con DDM2. </li><li> Centrifuga e lavare un totale di 2 volte con DDM2. </li><li> Trasferimento di cervelli e mezzi di comunicazione a un piatto sterile 35 millimetri Petri. </li></ol> VIII. Triturazione e placcatura in microscopio da dissezione <ol><li> Mettere 5 ul di DDM2 al centro di un vetrino coprioggetto. </li><li> Trasferire 1 cervello per questo calo di DDM2 con una punta di giallo. </li><li> Sotto il microscopio, utilizzare aghi calibro 27 a dadi il cervello di in piccoli pezzi (dovrebbe prendere &lt;1 minuto). </li><li> Sotto la guida visiva, rompere la punta di una pipetta di vetro che è stato tirato a punta fine in modo che i pezzi più grandi possono essere risucchiati delicatamente la punta della pipetta ed espulso di nuovo nel mezzo. Utilizziamo tubi di aspirazione bocca che sono forniti di serie con 100 microlitri di vetro ematocrito capillare. Nota: Fare attenzione a non avere le bolle nei media e sarà necessario determinare empiricamente la pipetta dimensione migliore da usare. Buoni consentono di dissociare il cervello con alcune singole cellule e ancora alcuni cespugli di grandi dimensioni, in circa 30 secondi / cerebrale. Quando si guarda a queste a maggior potenza, circa il 10-20% dei neuroni devono ancora alcuni processi rimanenti e ci saranno ancora alcuni grumi di grandi dimensioni. Se si dissociano troppo, allora tutte le cellule saranno rotondi e avranno subito danni così tanto che non sopravviverà. Questa fase richiede pratica e deve essere fatto in fretta perché c&#39;è una grande superficie-volume e il rapporto osmolarità e pH della goccia di DDM2 possono cambiare rapidamente. Tessuto deve essere posto in CO 2 incubatore nel più breve tempo possibile. </li><li> Scrivi sul coperchio capsula di Petri: &quot;genotipo, data e ora&quot;. </li><li> Mettere il piatto 35 millimetri petri in una capsula di Petri mm 100 (con kimwipe bagnato) e lasciare riposare in CO 2 incubatore per 30 min. </li><li> Inondare il piatto 35 mm con 1,5 ml di DDM2. </li><li> Mantenere le culture in incubatrice al 5% CO 2 incubatore (23 ° C). Nota: se non si ha accesso ad un raffreddamento CO 2 incubatore, utilizzare uno standard di mammifero tessuto cultura incubatore e sia messo in una stanza fresca e calore a 23 ° C, o mettere in laboratorio, spegnere temp, e l&#39;uso ghiaccio in un cassetto nella parte inferiore del incubatore per regolare temperatura ambiente intorno. </li></ol> IX. Le cellule di alimentazione <ol><li> In occasione della Giornata 1 (giorno successivo), aggiungere 0,5 ml di CNBM/B27 (Media Condizionata) per rendere 03:01 DDM2: CNBM/B27. </li><li> Il 5 ° giorno sostituire 1 ml di media per DDM2 03:01: CNBM/B27. </li><li> Conservare le cellule di alimentazione con 3:1 DDM2: CNBM/B27 ogni 4-5 giorni. Nota: Le culture possono essere coltivate senza i media condizionata non neuronali, ma i neuroni sembrano un po &#39;più fragili e sono più difficili per l&#39;uso negli esperimenti di elettrofisiologia. </li></ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. (1991).</li>
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<li>Su, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+synaptic+currents+in+Drosophila+mushroom+body+Kenyon+cells+are+mediated+by+alpha-bungarotoxin-sensitive+nAChRs+and+picrotoxin-sensitive+GABA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast synaptic currents in Drosophila mushroom body Kenyon cells are mediated by alpha-bungarotoxin-sensitive nAChRs and picrotoxin-sensitive GABA receptors.</a> J. Neurosci. 23, 9246-9253 (2003).</li>
<li>Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+mushroom+body+Kenyon+cells+generate+spontaneous+calcium+transients+mediated+by+PLTX-sensitive+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels.</a> J. Neurophysiol. 94, 491-500 (2005).</li>
<li>Campusano, J. M., Su, H., Jiang, S. A., Sicaeros, B., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nAChR-mediated+calcium+responses+and+plasticity+in+Drosophila+Kenyon+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Develop+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">nAChR-mediated calcium responses and plasticity in Drosophila Kenyon cells.</a> Develop Neurobiol. 67, 1520-1532 (2007).</li>
<li>Oh, H. -W., Campusano, J. M., Hilgenberg, L. G. W., Sun, X., Smith, M. A., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+analysis+of+chemical+synapses+and+gap+junctions+between+Drosophila+brain+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Develop+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural analysis of chemical synapses and gap junctions between Drosophila brain neurons in culture.</a> Develop Neurobiol. , (2007).</li>
</ol>

I neuroni raccolte dal cervello di roditori embrionale / postnatale possono essere coltivate in coltura cellulare primaria dove si estendono neuriti e la forma funzionale connessioni sinaptiche. Metodi per la preparazione di queste culture sono ben stabiliti e gli studi in colture neuronali roditori hanno svolto un ruolo fondamentale per identificare geni e fattori ambientali coinvolti nella regolazione della formazione di sinapsi e la funzione (Banker e Goslin, 1991). Mentre i neuroni degli insetti da una varietà di specie possono essere c...

Vetrini coprioggetto rivestimento: Mettere coprioggetto autoclave in un piatto da 60 millimetri di Petri. Pipettare 5 ul di Con A / mix laminina nella parte centrale di ogni coprioggetto. Luogo in 37 C incubatore per 2 ore. Sciacquare coprioggetto 3x con 100 ul di acqua autoclavata ciascuno. Usa vuoto attaccati ad una pipetta Pasteur sterile. Durante l&#39;ultimo risciacquo, sollevare il vetrino con una pinza ed asciugare entrambi i lati. Trasferire il vetrino di un piatto 35 millimetri Petri. Conservare a temperatura ambiente per un massimo di un mese.

culture primarie neuronale dal cervello di tardo fase drosophila pupae

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In questo video, dimostriamo la preparazione di colture primarie neuronali dal cervello di fine tappa Drosophila pupe. La procedura inizia con la rimozione di cervelli di animali a 70-78 ore dopo la formazione puparium. I cervelli isolati sono mostrati dopo incubazione breve papaina seguito da numerosi lavaggi in mezzo privo di siero di crescita. Il processo di dissociazione meccanica di ogni cervello in un calo del 5 ul di media su un vetrino è illustrato. Gli assoni e dendriti del post-mitotico neuroni sono sheered in prossimità del soma durante dissociazione, ma i neuroni cominciano a rigenerare i processi in poche ore di placcatura. Immagini mostrano fermenti vivi a 2 giorni. I neuroni continuano a elaborare processi durante la prima settimana della cultura. Specifiche popolazioni di neuroni possono essere identificati in coltura utilizzando GAL4 linee per guidare l&#39;espressione di marcatori specifici del tessuto fluorescente come GFP o RFP. Registrazioni di cellule intere hanno dimostrato l&#39;neuroni coltivati ​​forma funzionale, sinapsi colinergica attiva spontaneamente e GABAergici. Un segmento breve video che illustra le dinamiche del calcio nei neuroni in coltura con Fura-2 come un colorante indicatore di calcio di monitorare transienti di calcio spontanea e nicotina risposte di calcio evocate in un piatto di neuroni in coltura. Queste culture cervello pupa sono un sistema modello utile in cui gli strumenti genetica e farmacologica può essere utilizzato per identificare i fattori intrinseci ed estrinseci che influenzano la formazione e la funzione delle sinapsi centrale.

Questo video dimostra la preparazione di colture primarie neuronali dal cervello di fine tappa Drosophila pupe. Visto di culture live show crescita dei neuriti e l&#39;imaging di livelli di calcio con Fura-2.

Culture primarie neuronale dal cervello di tardo fase Drosophila Pupae

In questo video, dimostriamo la preparazione di colture neuronali primarie dai cervelli di pupe di Drosophila in stadio avanzato. La procedura inizia con la ...

Il mio nome è Diana Dowd e sono professoressa nei dipartimenti di Anatomia e Neurobiologia e di Biologia dello Sviluppo e Cellulare qui all'uc Irvine. Oggi vi parlerò della preparazione di colture neuronali da pupe di Drosophila. Questo procedimento prevede l'asportazione del cervello da pupe in stadio avanzato e, in genere, coltiviamo soltanto la regione del cervello centrale.In questa fase, le principali strutture anatomiche presenti nel cervello adulto sono già formate. Queste includono i lobi antennali, dove si trovano neuroni di proiezione che inviano i loro assoni fino alla regione del corpo fungiforme, e i neuroni del corpo fungiforme, le cellule di Kenyon, che hanno inviato i loro assoni verso i neuroni bersaglio attraverso i lobi alfa, beta e gamma. Nel giorno della coltura, la prima cosa che facciamo è entrare nell'armadietto a flusso laminare e preparare in modo sterile la soluzione enzimatica che utilizzeremo per dissociare il tessuto.E prepariamo anche il mezzo che utilizzeremo per la crescita delle cellule. Questo mezzo è ottenuto da steli che abbiamo preparato in anticipo. Il passaggio successivo consiste nel raccogliere le pupe che utilizzeremo per questa dissociazione o per la dissezione.E questo viene fatto all'esterno della cappa perché questi organismi vengono coltivati in provette contenenti lievito e ogni genere di altre sostanze. Pertanto, effettuiamo le fasi iniziali della dissezione all'esterno della cappa. Questi sono peepee appena prelevati dai lati di una provetta, e nella fila a sinistra abbiamo animali con occhi rossi, che rappresentano uno stadio adatto per la coltura.Questi sono leggermente più giovani, questi PPP qui sono leggermente più giovani. Hanno occhi arancioni o gialli, e questa è una linea 1 0 7 accettabile. Hanno occhi leggermente più brillanti rispetto ai comuni selvatici, in cui il colore a questi stadi sarebbe un po' più bruno.Tutte queste fasi sono adatte per la coltura, per ottenere colture cerebrali. Ok, il primo passaggio consiste nell'aggiungere alcune gocce di soluzione di dissezione proprio accanto ai pupi che ho estratto e allineato nella mia piastra di Petri. Utilizziamo i coperchi di piastre di Petri da 35 millimetri.Prendo quindi una pinzetta numero cinque in mano sinistra e una siringa da un CC per tubercolina con ago da 27 gauge all'estremità. Questi sono i miei due strumenti da dissezione. Per rimuovere la testa dal caso della pupilla o dalla pupi, in pratica devo utilizzare lo strumento i: tengo la pupi con la pinzetta nella mano sinistra e poi uso l'ago nella mano destra per rimuovere la parte anteriore del caso della pupilla.Quindi tiro indietro il tegumento e la testa fuoriesce dalla parte anteriore. Uso poi l'ago per recidere il corpo nella regione del collo, prendo la testa e la pongo nella goccia di soluzione fisiologica per dissezioni. Ripeterò questa procedura da 10 a 15 volte, poiché per ottenere una buona coltura preferisco avere da 10 a 15 animali per ogni genotipo.Ok, ora rimuoverò il cervello dalla testa dell'animale. Per farlo, utilizzo due siringhe per tubercolina, ciascuna dotata di un ago da 27 gauge. L'ago sinistro viene inserito attraverso il psis dell'animale per fissare la testa al fondo della piastra di Petri.Quindi uso l'ago destro per aprire una fessura sul lato destro, ed è da qui che spingerò fuori il cervello. Ok, e ora il passaggio successivo consiste nel posizionare l'ago sinistro sopra l'occhio sinistro. A questo punto spingerò effettivamente verso l'esterno e il cervello dovrebbe uscire dal lato destro attraverso la fessura.Ecco qui. Potete vederlo sul lato destro, e ora posso semplicemente usare l'ago destro per separarlo dal resto della capsula cefalica e dagli occhi. Bene. Ora, prima di effettuare la dissezione finale, che consiste nella rimozione dei lobi ottici, trasferisco l'encefalo in una goccia pulita di soluzione salina.Posso utilizzare una pipetta Eman per fare ciò, prelevandolo con l'estremità di una pipetta Eman da 20 microlitri, impostata a cinque microlitri, oppure posso trasferirlo direttamente sulle punzette. Questa è l'ultima fase della procedura di dissezione. Viene eseguita in una goccia fresca di soluzione salina e, in genere, qui dentro ho circa da 10 a 15 cervelli.Rimuovo quindi i lobi ottici da ciascuno utilizzando aghi da 27 gauge come strumenti di taglio, recidendo prima il lobo ottico sinistro e poi il lobo ottico destro su ciascun cervello. A questo punto, tutti i cervelli elaborati in questo modo verranno trasferiti in un tubo contenente la soluzione enzimatica, che sarà utilizzata per la dissociazione enzimatica. Tutti i cervelli appartenenti a un singolo genotipo vengono posti in un singolo tubo Eppendorf con tappo a vite che contiene un millilitro di soluzione enzimatica.E poi li inseriamo semplicemente in un portaprovette e li posizioniamo su un agitatore rotatorio, dove rimangono per 10-15 minuti a temperatura ambiente. Questo è effettivamente il tempo di dissociazione. Per completare il passaggio di dissociazione enzimatica, dobbiamo effettivamente rimuovere l'enzima.Portiamo quindi i tubi a una centrifuga EOR, inseriamo i tubi nella centrifuga e li centrifughiamo per tre minuti a 3000 giri al minuto. Dopo aver centrifugato i cervelli, li portiamo nell'appaio a flusso laminare. È qui che inizia la parte sterile della procedura.Ora non apriamo il tubo a meno che non siamo all'interno della cappa a flusso laminare, e rimuoveremo la soluzione enzimatica. La sostituiremo con la soluzione di dissezione, quindi centrifugheremo e laveremo più volte sia con la soluzione di dissezione che con un mezzo definito, che è il mezzo in cui coltiviamo le cellule. Va bene.La prima cosa che devo fare è posizionare una goccia di cinque microlitri di soluzione salina su ciascun cover slip presente in queste piastre di Petri. C'è un solo cover slip per piastra di Petri, ed è stato ricoperto con con a laminina; quindi pongo una goccia di cinque microlitri esattamente al centro del cover slip. È lì che si trova la mia goccia di laminina.È molto importante perché si desidera concentrare le cellule esattamente al centro del campo, poiché otteniamo circa 10.000 cellule per cervello, e questo è ciò con cui prepariamo una singola coltura. Bene, osservando ora al microscopio, ecco nove cervelli che sono già stati sottoposti alla procedura di dissociazione enzimatica. Si può notare che sono ancora sostanzialmente integri.Non hanno i loro lobi ottici. Questi sono stati rimossi, ma abbiamo solo la regione del cervello centrale e ora preleverò con la pipetta un singolo cervello per trasferirlo sulla goccia di cinque microlitri su un coprivetrino. E ripeto questa operazione quattro volte.Prendo due siringhe da un CC e applico a ciascuna un ago da 27 gauge. Ancora una volta, è molto importante notare che si tratta di strumenti di dissezione economici e monouso, quindi gli studenti universitari possono utilizzarli senza preoccuparsi del budget. Bene, ora ho i due aghi e procederò con la dissociazione meccanica iniziale, che consiste nel tagliare questo cervello in diversi pezzi, in modo da poter aspirare successivamente questi frammenti in una pipetta di vetro nell'arco di un minuto per completare la dissociazione finale.Quando eseguo questa operazione, non riduco i campioni in frammenti minuscoli; desidero semplicemente ridurre le dimensioni complessive, in modo da ottenere pezzi leggermente più piccoli rispetto all'intero cervello, che possano essere prelevati con la pipetta durante la dissociazione. Voglio inoltre procedere relativamente in fretta, poiché le gocce di mezzo sono piccole, il che comporta un elevato rapporto superficie-volume. Di conseguenza, il pH e l'osmolarità della soluzione potrebbero modificarsi se la soluzione rimane esposta per un certo periodo di tempo.Quando iniziai a eseguire questa procedura, in realtà preparavo solo due cervelli alla volta, due colture alla volta. Ora di solito ne preparo quattro, e adesso romperò la pipetta, ma non posso parlarne o fare commenti, giusto? Questa invece l'ho appena finita.La dissociazione, la dimensione della pipetta era piuttosto adatta. Sono riuscito a risucchiare il tessuto su e giù alcune volte, e si possono vedere cellule singole; abbiamo ancora degli aggregati, ma va bene così. Verranno rimossi con il lavaggio.Ora, le colture, non appena sono state seminate, vengono inserite in una seconda piastra di Petri e collocate nell'incubatore a CO2 entro pochi minuti, perché vogliamo assicurarci di mantenere il pH e l'osmolarità a un livello che ne supporti la sopravvivenza. Quindi le lasciamo qui per 30 minuti prima di allagare la piastra. Queste colture sono state preparate dai cervelli di pupe in stadio avanzato.La coltura è stata incubata per due giorni in un incubatore a CO2 e si possono osservare cellule singole che hanno sviluppato prolungamenti. Il grado di sviluppo dei prolungamenti è inferiore a quello visibile a cinque giorni e superiore a quello osservabile a un giorno. Mi chiamo Jorge Ano.Lavoro nel laboratorio Doubts. Vi mostrerò subito come eseguiamo l'esperimento, l'esperimento di imaging del calcio nelle colture cellulari che abbiamo appena preparato. Questo è un video di un esperimento di imaging del calcio in cui si vedono cellule blu che indicano livelli bassi di calcio e cellule rosse che indicano livelli elevati di calcio.Noteremo che alcune cellule diventano rosse, indicando un aumento dei livelli di calcio intracellulare. Questi eventi sono spontanei e transitori. Col tempo, i livelli di calcio tornano ai valori basali e, dopo un po', applicheremo un farmaco, in questo caso nicotina, e osserveremo un aumento dei livelli di calcio intracellulare nelle cellule.Applichiamo la nicotina per 100 secondi, quindi rimuoviamo la nicotina e successivamente le cellule tornano ai livelli basali di calcio. Pertanto, il vero vantaggio di questo sistema di coltura è che siamo in grado di ottenere le nostre colture sia da linee transgeniche che da linee mutanti di moscerini, diverse tra loro, in cui diverse sottopopolazioni di neuroni sono marcate con GFP. Questo è il cervello di una delle linee che abbiamo utilizzato, in cui il GFP è espresso nel corpo fungiforme, nelle cellule di Kenyon, neuroni coinvolti nella mediazione di comportamenti complessi, tra cui apprendimento e memoria.I corpi cellulari si trovano nella parte dorsale del cervello, nella zona indicata dalle frecce rosse. Queste strutture a forma di L, positive per GFP, sono in realtà le proiezioni assonali di queste cellule del corpo peduncolato keniane. Successivamente alla dissociazione del tessuto cerebrale.I neuroni rigenerano i loro prolungamenti in coltura e in questo caso è possibile identificare facilmente le cellule keniane positive per GFP. Queste risultano accessibili sia alla registrazione elettrofisiologica standard che agli studi di imaging del calcio. Pertanto, queste colture rappresentano strumenti davvero utili per esplorare i fattori genetici e ambientali importanti nella regolazione della funzione dei neuroni, che sappiamo essere cruciali nel mediare comportamenti complessi nell'animale adulto.

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Dettagli Questo protocollo un metodo semplificato utilizzato per condurre cellule vive nel contesto di un cervello larvale intatto. Approcci di imaging cellulare dal vivo hanno un valore inestimabile per lo studio delle divisioni asimmetriche di cellule staminali neurali così come altri processi neurogena e di sviluppo, in coerenza scoprendo i meccanismi che sono stati precedentemente trascurato.

Immagini dal vivo di<em&gt; Drosophila</em&gt; larvali neuroblasti

Questo protocollo descrive la dissezione e immunostaining del adulto Drosophila melanogaster tessuti del cervello. In particolare, questo protocollo evidenzia l'uso di Drosophila fungo del fotoricettore e corpo neuroni come sottoinsiemi di un neurone di esempio che possono essere utilizzati con precisione per scoprire i principi generali alla base di molti aspetti dello sviluppo neuronale.

Dissezione e macchiatura immunofluorescente del corpo di fungo e del fotoricettore neuroni nel cervello adulto Drosophila melanogaster

L'obiettivo del presente protocollo è quello di stabilire ex vivo Drosophila cultura larvale cervello ottimizzato per monitorare i ritmi circadiani molecolari con formazione immagine di time-lapse fluorescenza a lungo termine. L'applicazione di questo metodo a dosaggi farmacologici inoltre è discussa.

Cella singola risoluzione fluorescenza Live Imaging di Drosophila orologi circadiani nel cervello larvale cultura

Questo articolo fornisce protocolli dettagliati per infliggere lesioni cerebrali traumatiche penetranti (PTBI) a Drosophila adulta ed esaminare la neurogenesi risultante.

Stimolare e analizzare la neurogenesi adulta nel cervello centrale della Drosophila

È stato stabilito un metodo per riattivare le cellule staminali neurali quiescenti negli espianti cerebrali di Drosophila in coltura. Utilizzando questo metodo, il ruolo dei segnali sistemici può essere disaccoppiato dai segnali intrinseci del tessuto nella regolazione della quiescenza, dell'ingresso e dell'uscita delle cellule staminali neurali.

Riattivazione delle cellule staminali neurali negli espianti cerebrali di Drosophila in coltura

Scopri la preparazione di culture neuronali primarie dal cervello di pupae tardive di Drosophila. Questo metodo consente di studiare lo sviluppo neuronale e l'attività calcica in vitro.

Culture primarie neuronale dal cervello di tardo fase Drosophila Pupae

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