Analisi del DNA doppio filamento Break (DSB) di riparazione in cellule di mammifero

In questo protocollo video è dimostrato un metodo per misurare l'efficienza e l'accuratezza della riparazione del freno a doppio filamento del DNA mediante NHEJ o HR in una linea cellulare di mammifero. La procedura inizia con la generazione di una linea cellulare contenente una singola copia cromosomicamente integrata di una cassetta reporter NHEJ o HR. Queste cellule reporter vengono quindi trasfettate con una miscela di I SCE, un plasmide che esprime il rosso e DS e un plasmide.

Sceccio. Un'endonucleasi produce una rottura a doppio filamento nel costrutto reporter e DS RED funge da controllo della trasfezione. La percentuale di globuli rossi positivi alla GFP e DS viene quindi analizzata via fax al fine di quantificare l'efficienza di NHEJ o HR, se lo si desidera.

La fedeltà della riparazione viene analizzata salvando i prodotti reporter in e coli e sequenziando i prodotti di riparazione. In questo modo, l'efficienza e la fedeltà della rottura del filamento doppietto o della riparazione DSB in una data linea cellulare sono determinate sulla base della quantificazione citofluorimetrica degli eventi di riparazione e del sequenziamento dei prodotti di riparazione. Questo metodo presenta molti vantaggi rispetto ai metodi esistenti per l'analisi della riparazione dei freni a doppia corda.

Prima di tutto, questo metodo distingue specificamente tra una ricombinazione omologa e una non omologa e unificazione. Quindi il metodo è altamente quantitativo, consentendo l'analisi di milioni di cellule mediante citometria a flusso e quindi il metodo non richiede un ampio imballaggio di cellule dopo che la riparazione è completa per la selezione di CLS resistenti agli antibiotici. E infine, il completamento della riparazione può essere monitorato in tempo reale osservando l'aspetto delle celle verdi.

E questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della riparazione, come la misurazione dell'efficienza HR e HEGA in tipi di cellule mutanti del virus o dopo trattamenti farmacologici. Esaminare la riparazione A in diverse fasi del ciclo cellulare e misurare il tasso di riparazione Così generale. Generalmente le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché è importante ottenere una buona efficienza di trasfezione.

In questa procedura. Due cassette reporter vengono utilizzate per analizzare la riparazione di rotture di DNA a doppio filamento. Una cassetta viene utilizzata per esaminare la giunzione di estremità non omologa o la riparazione N-H-E-J-D-N-A.

L'altro è usato per esaminare la ricombinazione omologa o la riparazione del DNA HR l'estremità non omologa. La cassetta reporter di giunzione contiene un gene GFP con un introne di tre kilobasi ingegnerizzato dal gene PEM uno o GFP PEM uno. In breve, l'intro P one contiene un esone adenovirale affiancato da sequenze di riconoscimento per l'hindi tre e i SCE uno endonucleasi per l'induzione di rotture a doppio filamento.

I siti I SCE uno sono un orientamento invertito I SCE uno ha una sequenza di riconoscimento non palindroma, quindi due siti invertiti generano incompatibilità. Il DNA finisce in modo incompatibile. Le estremità del DNA imitano al meglio il dss naturale.

Una cassetta NAEJ non arrangiata è GFP negativa poiché l'esone adenovirale interrompe il G-F-P-O-R-F. Dopo l'induzione di rotture del DNA a doppio filamento da parte di ISEE uno, l'esone adenovirale viene rimosso e NHEJ ripristina la funzione del gene GFP. Anche la cassetta reporter a ricombinazione omologa si basa sul costrutto GFP PEM one nella cassetta HR.

Il primo esone della PEM G FP contiene una delezione di 22 coppie di basi combinata con l'inserimento di tre siti di restrizione. I SCE uno Hindi tre I SCE E uno. La cancellazione garantisce che la GFP non possa essere ricostituita da un evento NHEJ anche qui.

I siti I SCE one sono in orientamento invertito. Quindi la digestione lascia estremità incompatibili. La prima copia di GFP PMM è seguita da un promotore meno un TG, meno il primo esone e l'intro di GFP M1. Il costrutto intatto è GFP negativo dopo l'induzione di una rottura a doppio filamento da parte di I sce E una digestione.

Il gene funzionale GFP è ricostituito da un evento di conversione genica tra le due copie mutate del primo esone GFP PMM e altri tipi di riparazione DSB, come l'attraversamento in ginocchio a singolo filamento. E l'NHEJ non ricostituirà il gene GFP. Poiché manca la seconda copia del gene GFP.

La risoluzione del primo codone A TG e del secondo esone mediante incrocio o inginocchiamento a singolo filamento non ripristina l'attività della GFP. Questo design consente quindi il rilevamento esclusivo della risoluzione mediante conversione genica, che è la via HR predominante nelle cellule di mammifero. Per iniziare questa procedura, utilizzare il kit endo free di Kyogen per preparare un stock di alta qualità di plasmide reporter NHEJ o HR, linearizzare 10 microgrammi di plasmide e purificare il DNA dalla soluzione digestiva.

Consultare il protocollo scritto allegato per i dettagli sulla preparazione del plasmide. In preparazione alla trasfezione. Assicurati che i fibroblasti umani normali siano mantenuti nelle migliori condizioni di crescita.

Se si parte da una fiala congelata, dividere le cellule due volte prima della trasfezione. Se si parte da una piastra di confluenza, le celle si dividono una volta, le celle crescono fino al 70-80% di confluenza. Questo richiede circa due giorni per cinque volte 10 alla quinta cella placcata in una lastra da 100 millimetri.

Per una migliore efficienza di trasfezione, portare le cellule in crescita logaritmica. La coltura in crescita attiva contiene cellule allo stadio M viste come cellule arrotondate attaccate alla superficie per la trasfezione, raccolgono circa due volte 10 delle sei cellule da due piastre da 100 millimetri. È fondamentale non sovraccaricare la tripsina: le cellule interrompono la tripsina non appena l'80% delle cellule si è staccato dalla piastra.

Risospendere le cellule in soluzione di NHDF. Poiché le cellule sono sensibili alla soluzione di NHDF, ridurre al minimo il tempo di incubazione e mescolare delicatamente le cellule. Successivamente, utilizzare l'effettore amaxa nucleo per trasfettare le cellule con 0,5 microgrammi di costrutto reporter linearizzato per fibroblasti umani normali.

Queste condizioni di trasfezione si traducono nell'integrazione di una singola copia di un costrutto reporter per la maggior parte dell'integr 24 ore dopo la trasfezione a un milligrammo per millilitro di genetica o G quattro 18. Per selezionare le cellule con costrutti reporter cromosomicamente integrati, continuare la selezione per sette-10 giorni, quindi scegliere singole colonie resistenti G 4 1 8 o raggruppare i cloni resistenti. Espandi la coltura a circa cinque piastre da 100 millimetri.

Congelare tre piastre per un uso futuro ed espandere le due piastre rimanenti a cinque volte da 10 a una quinta cella per piastra da 100 millimetri. Dieci piastre da cento millimetri sono generalmente sufficienti per cinque trasfetti. Due giorni dopo la placcatura, quando le cellule contenenti il costrutto reporter hanno raggiunto il 70-80% di confluenza con una miscela di cinque microgrammi di plasmide che esprime I sce one e 0,1 microgrammi di plasmide rosso DS.

Come controllo dell'efficienza di trasfezione, utilizzare l'effettore AM maxon nucleo per trasfettare circa due volte 10 delle sei cellule da una coltura a crescita logaritmica. Poiché l'efficienza del DSP è misurata come rapporto tra i globuli rossi positivi alla GFP e i globuli rossi DS, le variazioni nella miscela di ISCE uno e plasmide rosso DS possono influenzare i risultati. La qualità del plasmide può anche influenzare i risultati modificando l'efficienza di trasfezione.

Pertanto, per ottenere misurazioni coerenti, è importante utilizzare la stessa miscela di plasmidi all'interno di un esperimento. Allo stesso tempo, preparare tre controlli di calibrazione per i fatti per ciascun controllo. Trasfetta circa due volte 10 delle sei cellule. I tre controlli sono cinque microgrammi di plasmide che esprime EGFP, cinque microgrammi di DS, plasmide rosso e cinque microgrammi.

Un plasmide di controllo che non esprime una proteina fluorescente. Tre giorni dopo la trasfezione, verificare l'efficienza della trasfezione e l'espressione delle proteine rosse GFP e DS mediante microscopio invertito fluorescente con filtri per la rilevazione di GFP e DS. Le cellule Red crescono per un giorno aggiuntivo prima dell'analisi fax, quattro giorni dopo la trasfezione raccolgono le cellule trasfettate I SCE one e le cellule di controllo. In questa fase, è fondamentale raccogliere tutte le cellule e avere celle di forma rotonda.

Per raggiungere questo obiettivo, utilizzare un tempo di tripsinizzazione più lungo o una maggiore concentrazione di tripsina. Esamina le cellule al microscopio per confermare che il 99% delle cellule si è staccato dalla piastra e ha una forma rotonda. Risospendere le cellule in 500 microlitri di PBS e trasferirle in tubi fax.

Mantenere le cellule sul ghiaccio e proteggerle dalla luce mentre è possibile conservare le cellule sul ghiaccio per alcune ore. Per ottenere i migliori risultati, analizzare le cellule subito dopo la raccolta. Successivamente, calibrare i fatti con TFP DS RED e i controlli negativi.

Regolare la compensazione della tensione e del colore in modo da includere tutte le celle fluorescenti nell'analisi. Si tenga presente che l'intensità fluorescente dei campioni sperimentali è inferiore a quella dei controlli. Dopo aver calibrato i fatti con i controlli, analizzare le cellule trasfettate I SCE one contando almeno 20.000 cellule per ogni trattamento per prevenire potenziali interferenze tra GFP e ds.

fluorescenza rossa mantiene la percentuale di globuli rossi positivi per GFP o DS positivi al di sotto del 25%Se la percentuale è più alta, ridurre la quantità di DS RED o I sce E un plasmide. La percentuale di cellule GFP positive corrisponde all'efficienza della riparazione D-N-A-D-S-P e la percentuale di cellule rosse DS positive indica l'efficienza della trasfezione. Calcolare l'efficienza relativa della riparazione D-N-A-D-S-P come rapporto tra le cellule GFP positive e le cellule rosse DS positive.

Al fine di determinare l'accuratezza delle ingiunzioni riparate, salvare i costrutti reporter digerendo il DNA genomico con la circolarizzazione dell'enzima eco R one e la trasformazione in cellule di e coli competenti. Questo salvataggio è possibile poiché i costrutti originali contengono un'origine batterica di replicazione analizzata mediante restrizione, digestione e sequenziamento. Questi sono fatti tipici, risultati delle transezioni di controllo e degli esperimenti NHEJ e HR.

L'intensità della fluorescenza e il numero di cellule fluorescenti sono inferiori nelle celle trasfettate I SCE one rispetto ai controlli. La differenza nel segnale di fluorescenza è dovuta alla differenza nel numero di copie dei costrutti GFP e DS RED in queste cellule. Ogni cella dell'esperimento contiene una copia del costrutto del reporter integrato.

Pertanto, gli eventi di riparazione riusciti ricostituiscono il gene GFP in una frazione delle cellule. L'efficienza di NHEJ e HR è calcolata come rapporto tra i globuli rossi positivi per GFP e DS positivi. L'NHEA è un processo più efficiente dell'HR nelle cellule umane, nei fibroblasti umani, l'efficienza NHEJ è tipicamente compresa tra 0,6 e 1,3 e l'efficienza HR è compresa tra 0,05 e 0,3.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della riparazione del DNA per esplorare i ruoli di vari fattori nell'HEG e nell'HR e studiare la cinetica e la regolazione di NHEG e HR nelle cellule di mammifero. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare l'efficienza e l'accuratezza di HR e GJ nelle cellule di mammifero utilizzando un test fluorescente.