Name: Su larga scala Schermi di librerie metagenomiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 5 s
Description: Scopri l'inoculazione automatizzata di colonie da librerie metagenomiche su membrane di nylon utilizzando sistemi robotici. Questo metodo consente di posizionare 10.000 colonie con elevata precisione per studi genomici avanzati.

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1. Ibridazione procedura Un tubo di ibridazione sono necessari 1 o 2 membrane (taglia 22 per 22 cm). Utilizzare 50 ml di miscela di ibridazione e 0,5 mg di DNA sonda (10 ng / ml concentrazione finale) per tubo ibridazione. Per ottenere i migliori risultati, utilizzare gel purificato DNA come sonda. Se scaling up preparazione della sonda, aumentare il numero di tubi, piuttosto che aumentando la quantità di reagenti per provetta. Sonda preparazione (0,5 mg DNA): <ol><li> Diluire 15 ml di cross-linker soluzione con 60 ml di acqua. </li><li> Diluire il DNA a 10 ng / mL con acqua a 50 microlitri di volume totale in un tappo a vite microprovette. </li><li> DNA denaturare per 5 minuti in acqua bollente. </li><li> Trasferire rapidamente al ghiaccio e lasciate raffreddare per 5 min. Spin brevemente. </li><li> Aggiungere 50 ml di tampone di reazione e mescolare delicatamente. </li><li> Aggiungere 10 ml di etichettatura dei reagenti e mescolare delicatamente. </li><li> Aggiungere 50 microlitri della diluito cross-linker soluzione dal punto 1 e mescolare delicatamente. Vortex delicatamente e centrifugare brevemente. </li><li> Incubare a 37 ° C per 30 min. </li><li> Tenere sul ghiaccio per un massimo di 2 ore o aggiungere un uguale volume di 100% glicerolo e conservare a -20 ° C. Nota: utilizzare l&#39;acqua fornita con il kit. Conservare tutti i reagenti su ghiaccio salvo diversa indicazione. </li></ol> Preparazione della membrana e l&#39;ibridazione <ol><li> Preriscaldare 50 ml di tampone di ibridazione e tubo di ibridazione a 60 ° C. </li><li> Aggiungere la soluzione tampone di ibridazione al tubo di ibridazione. Arrotolare membrana (s) e aggiungere al tubo ibridazione. (Se l&#39;aggiunta di 2 membrane per ogni tubo, primo tiro alto di una membrana completamente, poi arrotolare la membrana sopra l&#39;altra nella stessa direzione.) </li><li> Incubare la provetta in ibridazione a 60 ° C per almeno ½ h. (Assicurarsi membrana (s) ottiene bagnato accuratamente.) </li><li> Trasferire circa 1 ml di tampone di ibridazione con una pipetta lunga dal tubo di ibridazione per il tubo contenente la sonda marcata. Vortex delicatamente e centrifugare brevemente. Trasferimento miscela di nuovo al tubo di ibridazione. </li><li> Incubare a 60 ° C durante la notte. Nota: Utilizzare pinze e guanti quando si maneggiano le membrane. Contenuto mix di tubi di ibridazione con delicatezza perché l&#39;agitazione eccessiva provoca la formazione permanente di schiuma indesiderati. Membrane dovrebbero essere aggiunti in caso di pioggia; immergere in tampone di ibridazione o di acqua se necessario e scaricare il liquido in eccesso prima di aggiungere. </li></ol> 2. Procedura di rilevamento Membrane lavaggio <ol><li> Preriscaldare il tampone di lavaggio primario a 60 ° C. (Usa forno a microonde e / o la piastra di riscaldamento). </li><li> Se ci sono 2 membrane in una provetta di ibridazione, il trasferimento di una membrana di un ambiente pulito, caldo, tubo di ibridazione vuoto. </li><li> Brevemente risciacquare tubo ibridazione con circa 50 ml di tampone di lavaggio primario. </li><li> Aggiungere circa 100 ml di tampone di lavaggio per tubo primario ibridazione e incubare a 60 ° C per 10 min. </li><li> Ripetere il punto 3 e 4. </li><li> Trasferimento membrana per il lavaggio del contenitore e incubare con almeno 250 ml di tampone di lavaggio secondario a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Ripetere il passaggio 6. Nota: Le membrane possono essere conservati nel tampone di lavaggio secondario a temperatura ambiente per un massimo di ½ h prima della generazione del segnale. </li></ol> Generazione del segnale e la rilevazione (procedura per una membrana) <ol><li> Due pezzi di nastro SaranWrap piatto sul tavolo (una per la fase 2 e uno per il punto 4). </li><li> Cura di scarico il tampone in eccesso dalla membrana toccando gli angoli della membrana contro il lato del contenitore e trasferire la membrana sul SaranWrap (lato di campionamento fino). </li><li> Versare 6-7 ml di reagente ECF oltre a membrana e piega avvolgere Saran su membrana. Cura la distribuzione del reagente ECF oltre membrana con delicatezza lo spostamento di un Kimwipe il SaranWrap. Incubare per 5 min. </li><li> Defluire reagente in eccesso ECF dalla membrana e trasferirlo sul nuovo SaranWrap, avvolgere volte rispetto a membrana, e sigillare i bordi con del nastro adesivo. Coprire la membrana con un foglio di alluminio. Incubare per 1-2 ore. </li><li> Preparare la lastra di vetro dello scanner, distribuendo 1-2 ml di reagente ECF sopra la lastra di vetro. Poi trasferire la membrana sulla lastra di vetro (lato campione verso il basso) e distribuire un altro 1-2 ml di reagente ECF sulla membrana. Sovrapposizione con SaranWrap e spingere le bolle d&#39;aria lontano dalla membrana. (Si può mettere una piastra rigida sulla parte superiore della membrana SaranWrap tenere premuto contro la lastra di vetro.) </li><li> Utilizzare il Fuji FLA-5100 scanner a fluorescenza (&quot;1 laser 1 immagine&quot; mode) con le seguenti impostazioni: eccitazione 473 nm, filtro di rilevamento LPB (510 nm), la risoluzione 50 micron, laurea segnale a 16-bit, CH1 400 V. (Scan dura circa 15-20 minuti per membrana di taglia 22 per 22 cm.) Opzionale: </li><li> Lasciate riposare per 2-4 ore (o più). </li><li> Ripetere la scansione del passaggio 6. </li></ol> 3. Smontaggio e stoccaggio procedura (NUF versione) <ol><li> Trasferimento della membrana al 100% ethanol e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti con agitazione. </li><li> Sostituire con fresca etanolo al 100% e incubare una notte a temperatura ambiente. (Membrana può rimanere in etanolo per diversi giorni.) </li><li> Sostituire l&#39;etanolo con acqua distillata e incubare a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Aggiungere 100 ml di acqua e 5 ml di 10% SDS (finale 0,5% SDS) a un tubo di ibridazione e mescolare delicatamente. Aggiungi membrana. </li><li> Incubare a 80 ° C per 1 h. </li><li> Trasferimento a membrana su un contenitore pulito e vuoto. </li><li> Aggiungere 500 ml di acqua e 5 ml di 10% SDS (finale 0,1% SDS) e un bicchiere di calore a bollore vigoroso nel forno a microonde. </li><li> Versare la quasi bollente soluzione 0,1% SDS sopra la membrana e agitare delicatamente per alcuni minuti. Lasciare raffreddare a temperatura ambiente. </li><li> Sciacquare in almeno 250 ml di soluzione sterile 100 mM Tris pH 8 per almeno 10 min. </li><li> Membrana avvolgere in SaranWrap e chiudere i bordi accuratamente con nastri. Conservare a 4 ° C. (Membrane non deve mai asciugarsi.) </li></ol>

La procedura di stripping non è stato ottimizzato. Tuttavia, la procedura di stripping dato nelle istruzioni del produttore (2 lavaggi ciascuno, 10 minuti in 100% di etanolo, 1 lavaggio di 1 ora a 60 ° C a 0,5% SDS) è insufficiente. Almeno notte di incubazione in etanolo al 100% è necessario per sciogliere il prodotto di reazione ECF; diversi giorni di incubazione in 100% di etanolo non sembra avere effetti negativi sulla capacità di reprobe la membrana. Trattamento SDS del produttore sembra essere insufficiente. NUF ha provato 1 ora a 80 °...

Combinazione pacco RPN3692 = RPN3680 + RPN3685

su larga scala schermi di librerie metagenomiche

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomica frammenti di archiviare librerie di grandi dimensioni contigue sequenze genomiche da microrganismi senza la necessità di coltivazione precedente. Generazione di una procedura semplificata per la creazione e lo screening librerie metagenomiche è quindi utile per una efficiente high-throughput indagini sulle proprietà genetiche e metaboliche di assemblaggi microbica incolti. Qui, i protocolli chiave sono presentati in video, che vi proponiamo è il formato più utile per descrivere con precisione un lungo processo che dipende alternativamente sulla strumentazione robotica e (umano) interventi manuali. In primo luogo, abbiamo impiegato robotica di individuare cloni biblioteca su membrane ad alta densità macroarray, ognuno dei quali può contenere colonie duplicati da ventiquattro tavole biblioteca da 384 pozzetti. L&#39;automazione è fondamentale per questa procedura non solo per precisione e velocità, ma anche per la miniaturizzazione di scala necessarie per montare il gran numero di cloni biblioteca accordi spaziali ad alta densità. Una volta generato, siamo prossimi dimostrato come le membrane macroarray possono essere sottoposti a screening per geni di interesse utilizzando versioni modificate di protocolli standard per l&#39;etichettatura della sonda, l&#39;ibridazione della membrana, e la rilevazione del segnale. Abbiamo completato la dimostrazione visiva di queste procedure, con dettagliate descrizioni scritte delle fasi coinvolte ed i materiali necessari, che sono tutti disponibili online a fianco del video.

Su larga scala Schermi di librerie metagenomiche

Le librerie metagenomiche archiviano ampi frammenti di sequenze genomiche contigue provenienti da microrganismi senza richiedere una precedente coltivazione. La generazione di una ...

Il nostro obiettivo qui è inoculare delle colonie provenienti da alcune di queste librerie metagenomiche su filtri di membrana, e ciascuno di questi filtri può contenere 10.000 colonie. Quindi quello che sta facendo rums in questo momento è posizionare questo filtro di nylon su un blocco e lisciarlo un po'. È, è in una piccola quantità di liquido, si tratta semplicemente del mezzo di crescita, il brodo luria.E ciò che farà successivamente è trasferire questa membrana inumidita sul robot, che inoculerà automaticamente la membrana con 10.000 colonie. I sistemi robotici sono essenziali per questo tipo di procedura, poiché nessun essere umano possiede la pazienza o la precisione necessarie per depositare 10.000 colonie su una di queste membrane. I robot sono tra gli strumenti che hanno effettivamente fatto progredire la scienza genomica, consentendo di eseguire operazioni molto ripetitive e su piccola scala spaziale con elevata accuratezza.In questo momento, il robot sta venendo configurato per alimentare queste 3 piastre da 84 pozzetti, ognuno dei quali contiene una colonia individuale dalla libreria metagenomica. Al momento, il robot sta sterilizzando gli aghi inoculatori che utilizzerà per depositare i campioni sulla membrana. Il processo prevede il passaggio attraverso diverse soluzioni, tra cui il 70% di etanolo, per sterilizzarli, dopodiché gli aghi inoculatori verranno immersi in una piastra da 3 x 84 pozzetti contenente tutte le colonie.Ora viene sterilizzato e asciugato mediante luce. Dopo che gli aghi per inoculazione sono stati asciugati, una piastra verrà inserita nel robot. Ognuna di quelle colonie viene effettivamente trasferita e duplicata, il che funge da controllo.Stiamo quindi cercando due colonie identiche in grado di mostrare un segnale dall'ibridazione. Dopo che tutte le colonie sono state depositate sul filtro, nuovamente viene applicato alla piastra augurata che si vede qui, e poi viene incubata a 37 gradi C per tutta la notte.Ciò che accade è che le colonie crescono separatamente e ciò che si osserva nell'array sono 10.000 colonie su un filtro. Ovviamente, ognuna di queste colonie contiene molte, molte, molte copie del DNA ricombinante, in questo caso il DNA metagenomico. Questo campione proviene dall'oceano centrale del Pacifico settentrionale, da noi ottenuto.Ci&ograve; che Saltram far&agrave; successivamente &egrave; trasferire quella membrana in una serie di soluzioni. La prima soluzione in cui la trasferisce &egrave; una soluzione basica di idrossido di sodio, che servir&agrave; a lizzare le colonie. Questa sostanza dissolve fondamentalmente la parete cellulare e libera il DNA, consentendo al DNA di entrare in contatto con il filtro.Quindi, ciò che accade qui è che tutte le pareti cellulari di tutti i batteri nelle colonie si stanno dissolvendo e il DNA è ora libero. Dopo cinque minuti in idrossido di sodio, i filtri vengono quindi trasferiti. Questo è soltanto un punto d'appoggio perché subito dopo andranno nel vapore bollente.Questa è quindi la seconda parte del passaggio di lisi. Inizialmente, le cellule sono state trattate con una soluzione fortemente basica di idrossido di sodio e detergente laurilsolfato di sodio. Ora, queste colonie sono sottoposte a un elevato calore, calore a vapore di cento gradi Celsius.La combinazione di quella base, del detergente e di questo calore lizzerà completamente le cellule e il DNA sarà libero sul filtro. Dopo cinque minuti nel bagno a vapore, si trasferirà il filtro in una soluzione neutrale. La soluzione neutrale neutralizza completamente la base e successivamente il filtro verrà essiccato.Ora questa è la soluzione neutralizzante, e il filtro rimane nella soluzione neutralizzante per altri cinque minuti. Successivamente il filtro viene trasferito sulla carta da filtro e lasciato asciugare, tipicamente durante la notte. Dopo che le membrane con le cellule lisate sono state essiccate durante la notte, vengono collocate in una soluzione di tris, EDTA e proteasi K, e la proteasi K ha la funzione di rimuovere tutte le proteine presenti sulla membrana.Si osserva che il rum ha capovolto la membrana per assicurarsi che tutte le colonie vengano ricoperte con la proteasi K. Questo enzima digerirà gran parte del materiale cellulare estraneo e delle proteine. Dopo un'incubazione di mezz'ora in proteasi K a 37 gradi C, le membrane vengono semplicemente estratte dalla soluzione e fatte asciugare su carta da filtro durante la notte. A questo punto, sono pronte per il passaggio successivo, ovvero l'ibridazione.Il mio nome è Vin fm. Sono un ricercatore postdottorato nel laboratorio di Delong. Al MIT utilizzo la tecnologia di macroarray per l'analisi di marcatori filogenetici e anche di geni funzionali.È stato mostrato come sono state preparate quelle librerie di macroarray. Ti guiderò attraverso il resto della procedura per eseguire il screening. Ecco un macroarray; prima di procedere, dobbiamo fissare il DNA sulla membrana stessa mediante incrocio incrociato con raggi UV.Lo facciamo con un incrociatore UV, inseriamo il campione, impostiamo l'incrocio automatico e avviamo. Una volta completato l'incrocio, preferisco tagliare le membrane in due metà. Faccio ciò perché queste membrane verranno ibridate all'interno di provette per ibridazione e tagliarle a metà consente all'intera superficie interna della membrana di essere completamente esposta alla soluzione di ibridazione.Si può notare che la membrana è posizionata perfettamente all'interno del tubo, senza ripiegarsi su se stessa. Quindi, qui la membrana è correttamente alloggiata all'interno del tubo di ibridazione. Il passo successivo consiste nell'aggiungere il tampone di ibridazione.Contenente la sonda, che ho in questo altro tubo preriscaldato a 60 gradi. Questa è la mia temperatura di ibridazione preferita. Quindi, prima di procedere, o meglio, mentre lo faccio, spiegherò che il tampone di ibridazione è stato inviato insieme al kit di rilevamento dal produttore.Si tratta del buffer di ibridazione, che integriamo con un reagente di blocco. Sono inoltre inclusi buffer fosfato, SDS, cloruro di magnesio e cloruro di sodio, oltre a una certa quantità di urea. Bene. Successivamente, si pone questa provetta con il suo buffer di ibridazione, la membrana e la sonda all'interno del fornetto per ibridazione, che ho impostato a 60 gradi, lasciandola incubare per tutta la notte senza ulteriori interventi.Dopo un'incubazione ideale durante la notte, è il momento di lavare le membrane per rimuovere qualsiasi sonda non legata. Non ci sono materiali pericolosi nella preparazione del tampone di ibridazione o della sonda. Pertanto, è sicuro smaltirlo nello scarico.Vado a prendere il mio tampone di lavaggio primario, che si sta riscaldando a 60 gradi. È stato riscaldato correttamente alla stessa temperatura alla quale le membrane sono state ibridate durante la notte. Anche il lavaggio verrà effettuato alla stessa temperatura.Quindi, di solito eseguo tre lavaggi con il buffer di lavaggio primario, ciascuno con un'incubazione di circa cinque-dieci minuti. Ancora una volta, il buffer di lavaggio non contiene sostanze chimiche pericolose o radioattive; dopo ogni ciclo di lavaggio, è possibile versare il liquido nel lavandino. Sono stati effettuati tre lavaggi con il buffer di lavaggio primario a 60 gradi.Ora le membrane sono pronte per il secondo lavaggio, che porta le membrane al pH appropriato per l'esposizione ai reagenti chimici di rilevamento dell'ECF. Successivamente, lavare le membrane nel tampone di secondo lavaggio a temperatura ambiente. Ora è possibile utilizzare pinzette per rimuovere le membrane oppure, se si è molto attenti, si può usare la mano guantata toccando le membrane soltanto sul retro o sui bordi, in modo da non macchiarle con eventuali contaminanti presenti sulle mani, anche se guantate.Dobbiamo trasferire le membrane in un contenitore che contiene un tampone di lavaggio secondario preportato e portato a temperatura ambiente. Posizionarle bene e in piano. A volte le membrane si sovrappongono, ma non è così importante.Ricordare che questo particolare passaggio serve semplicemente a equilibrare il pH delle membrane. Successivamente, lasciare incubare. È possibile eseguire un leggero movimento oscillatorio, se lo si desidera.Non ho trovato che questo sia particolarmente utile né dannoso in un senso o nell'altro. Quindi lascio semplicemente il campione sul mio banco per altri cinque-dieci minuti, e poi ripeto il lavaggio secondario per la seconda volta. Il secondo lavaggio del lavaggio secondario è completato.Ora è il momento di prepararsi per la rilevazione, espandere. Sto srotolando della pellicola trasparente e le membrane verranno posizionate sulla pellicola con il portareagenti per la rilevazione rivolto verso l'alto rispetto alle membrane, quindi ripiegherò la pellicola trasparente all'indietro. In questo modo si crea una piccola busta ideale per contenere il reagente di rilevazione.Ecco qui le nostre membrane. Ho versato qualsiasi eccesso di tampone di lavaggio su alcuni fazzoletti di carta asciutti, una pila, e ho disposto le membrane su pellicola trasparente. Avete a disposizione un rilevatore ECF già pre-miscelato.Questi possono di solito essere conservati nel congelatore per diversi mesi; versare semplicemente i reagenti sulla membrana. Pieghiamo il materiale avanzato. Quindi eseguire l'avvolgimento.E creo una piccola sacca ripiegando le estremità o i bordi e proteggo l'intero processo di rilevamento con della pellicola di alluminio. Lascio agire anche per circa cinque-dieci minuti. È il momento di eliminare i reagenti di rilevamento da questa prima busta.Si noti che ho fissato una parte della pellicola adesiva sul mio banco. Può risultare utile farlo spesso per evitare l'adesione tipica della pellicola in cera. Ancora una volta, è utile asciugare tamponando su un mucchio di tovaglioli di carta, quindi srotolare il campione nella pellicola fresca e pulita che si è precedentemente predisposta sul banco.Ok, quindi i reagenti di rilevamento sono stati rimossi per la maggior parte; ora le membrane sono pronte per un'incubazione di circa due ore per consentire lo sviluppo del segnale. Sono trascorse due ore e siamo pronti a rilevare il segnale sulle nostre membrane. Per farlo, utilizziamo una scansione delle membrane mediante uno scanner a fluorescenza, maneggiando nuovamente le membrane solo ai bordi.Quello che potrebbe risultare utile è utilizzare una pipetta per rimuovere eventuali bolle d'aria che si formano tra la membrana e il vetro. A questo punto siamo pronti per effettuare la scansione. Impostare l'area coperta sulla piastra frontale dalle nostre membrane e scansionare a quattro e 73 nanometri.Quindi, quando ingrandite una scansione completata, otterrete un'immagine simile a questa. È presente un segnale proprio qui. Ogni volta che si hanno due punti opposti, si tratta dell'indicazione di un segnale positivo.Ecco un esempio, ecco un secondo esempio. Una volta stabilito a quale parte della membrana corrisponde il segnale, si risale alla piastra e ai pozzetti cui tale segnale specifico corrisponde. Ciò permette di identificare quale fo smidt porta il gene specifico che si intendeva individuare con lo screening.E una volta identificato lo smid, puoi cercare te stesso. Un modo consiste semplicemente nel sequenziare l'intero inserto dello smid e trovare il gene che ti interessa.

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