Misurare la rigidezza flessionale di cellule batteriche Utilizzando una trappola ottica
April 26th, 2010
Vi presentiamo un protocollo per la piegatura di cellule batteriche filamentose attaccato ad una copertura antiscivolo della superficie di un dispositivo ottico per misurare la rigidità cellulare flessione.
Al fine di determinare la rigidità alla flessione delle singole cellule coli, in primo luogo, far crescere i batteri in fase esponenziale e poi attaccarli a una superficie di vetrino coprioggetti trattata chimicamente. Lascia che le cellule già attaccate alla superficie crescano ulteriormente in modo che sviluppino estremità flessibili. Quindi fluire in perline dielettriche, intrappolare una perlina e piegarla alla punta flessibile di una cella.
La fase finale della procedura consiste nel piegare la cella con la trappola ottica e misurare i dati di spostamento forzato risultanti. La rigidezza flessionale della cella può essere calcolata mediante un adattamento lineare ai dati di spostamento forzato. Ciao, sono Steven Wong del laboratorio del professor Joshua Shere presso il Louis Sickler Institute of Integrative Genomics e il Dipartimento di Fisica dell'Università di Princeton.
Oggi vi mostreremo una procedura di piegatura delle singole cellule ecologiche e la rigidità delle celle coniugali. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare i contributi di diverse strutture intracellulari all'integrità meccanica delle cellule batteriche. Quindi iniziamo.
Per iniziare questa procedura, coltivare tre millilitri di qualsiasi cellula di e coli in LB da medio a esponenziale. Una volta che le cellule raggiungono una densità ottica a 600 nanometri compresa tra 0,2 e 0,4, integrare la coltura con 50 microgrammi per millilitro di cefalexina per 15 minuti per indurre la crescita filamentosa. Durante questi 15 minuti, creare una camera di flusso.
Attacca due pezzi di nastro biadesivo con uno spazio di tre millimetri tra i pezzi a un vetrino e fissa un vetrino coprioggetti sopra. Lo spazio tra i pezzi di nastro crea un canale per il flusso del liquido. Rivestire il vetrino coprioggetto con PEI facendo scorrere 10 microlitri di polietalina all'1% diluita in acqua nella camera di flusso con una micropipetta, incubare per cinque minuti.
Quindi lavare facendo scorrere 200 microlitri di acqua ad un'estremità della camera e raccogliendo all'altra estremità con un aspirapolvere. Dopo 15 minuti di crescita dei batteri in presenza di cefalexina, centrifugare un millilitro di cellule in una microcentrifuga e risospendere in 200 microlitri di LV con cefalexina. Quindi, di nuovo, utilizzare una micropipetta su un'estremità e aspirare sull'altra estremità per far fluire 50 microlitri della coltura cellulare concentrata nella camera che tiene in incubazione il vetrino coprioggetto rivestito per tre minuti.
Quindi lavare con 50 microlitri di Vel B integrato con cefalexina. Per rimuovere le cellule non attaccate, incubare la camera a 37 gradi Celsius per 30 minuti a un'ora per consentire alle cellule attaccate di crescere prima di posizionarle sullo strumento di intrappolamento ottico mentre le cellule sono in incubazione. Preparare le perle rivestite di polilisina incubando tre microlitri di perle di polistirene di diametro 0,5 micrometri in una di polilisina allo 0,1% diluita in acqua per 30 minuti.
Quando le perle hanno finito di incubare, lavarle tre volte facendole girare verso il basso in una microcentrifuga e sospendendole in un millilitro d'acqua, procedere a legare le perle ai batteri e misurare la rigidità di legame delle cellule. L'aspetto più difficile di questo protocollo è essere in grado di riconoscere, localizzare e riconoscere una buona cella per le misure di flessione, rigidità. E una buona cella è quella con un'estremità bloccata ben definita e un'estremità libera Luogo.
La camera di flusso al microscopio cerca una cellula con un'estremità bloccata ben definita. Alcune celle sono attaccate solo a una punta e la forza di flessione all'altra punta porta a un'intera cellula che ruota piuttosto che piegarsi. Per trovare una cella adatta, piega rapidamente ogni cella con la trappola utilizzando il movimento del palco controllato dal joystick.
Quando viene trovata una cellula adatta, diluire la soluzione di microsfere di un fattore due in libbre con cefalexina, aggiungere 30 microlitri di soluzione di perline alla camera di flusso pipettandola in un'estremità e facendo fuoriuscire delicatamente all'altra estremità con un panno Kim wipe, intrappolare otticamente una perlina galleggiante e toccarla con la punta libera di una cellula. Lavare nuovamente la camera con micropipetta e utilizzando un fazzoletto bianco Kim con 50 microlitri di cefalexina in LB per rimuovere le perle non attaccate. Successivamente, esegui un programma di visualizzazione lab scritto personalizzato per applicare le forze di flessione alla cella e registrare i dati sullo spostamento forzato.
Innanzitutto, calibrare la risposta del rivelatore scansionando RA il cordone attaccato all'interno del raggio laser di rilevamento e registrando i segnali di tensione PSD 3D. Quindi identificare l'asse lungo della cellula in un'immagine al microscopio. Dopo aver identificato l'asse lungo della cella, spostare la cella a passi in una direzione perpendicolare all'asse lungo mentre si sposta il record della cella, la distanza percorsa e lo spostamento del cordone dal centro della trappola ottica.
Infine, convertire i valori di spostamento in forza applicata utilizzando la rigidezza dell'intrappolamento misurata in precedenza e salvare. Lo spostamento della punta e la forza da limare qui sono dati di spostamento forzato per una singola cella. La pendenza di questa linea è la rigidità alla flessione della cella.
Ti abbiamo appena mostrato come sposare la rigidità alla flessione dell'e coli con una trappola ottica. Quando si utilizza questa procedura, è importante ricordare di trovare una buona cella con un'estremità bloccata ben definita e un'estremità libera. Quindi questo è tutto.
Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per misurare la rigidità flessionale delle cellule batteriche filamentose utilizzando tecniche di intrappolamento ottico. Il metodo prevede la crescita di cellule di E. coli, il loro aggancio a una lamella di copertura e l'applicazione di forze di flessione per valutare le loro proprietà meccaniche.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Microbiologia
- Biofisica
- Meccanica cellulare
Sfondo
- Comprendere le proprietà meccaniche delle cellule batteriche è fondamentale per capire il loro comportamento e la loro integrità.
- La crescita filamentosa di E. coli può essere indotta per studiare la loro rigidità alla flessione.
- Le trappole ottiche forniscono un metodo non invasivo per applicare forze su singole cellule.
- Studi precedenti si sono concentrati sull'integrità meccanica delle cellule in varie condizioni.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un protocollo affidabile per misurare la rigidità flessionale delle cellule di E. coli.
- Investigare i contributi delle strutture intracellulari alla meccanica cellulare.
- Migliorare la comprensione del comportamento delle cellule batteriche sotto stress meccanico.
Metodi utilizzati
- Coltivare le cellule di E. coli in terreno LB fino alla fase esponenziale.
- Indurre la crescita filamentosa utilizzando cefalexina.
- Agganciare le cellule a una lamella di copertura trattata chimicamente.
- Utilizzare trappole ottiche per applicare forze di flessione e misurare i dati di spostamento.
Principali risultati
- Il protocollo misura con successo la rigidità flessionale delle singole cellule di E. coli.
- L'analisi dei dati rivela la relazione tra la forza applicata e lo spostamento cellulare.
- L'identificazione di cellule adatte alla misurazione è fondamentale per risultati accurati.
- I risultati contribuiscono alla comprensione della meccanica delle cellule batteriche.
Conclusioni
- Il protocollo sviluppato è efficace per studiare le proprietà meccaniche delle cellule batteriche.
- L'intrappolamento ottico è uno strumento prezioso per investigare la rigidità cellulare.
- Studi futuri possono basarsi su questi risultati per esplorare altri aspetti della meccanica cellulare.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Measuring bacterial cell stiffness provides a quantitative readout of structural integrity that can inform target validation in antimicrobial discovery. This biophysical assay enables mechanistic de-risking by linking genetic or chemical perturbations to functional mechanical phenotypes. The method supports early-stage hypothesis testing where changes in bending rigidity reflect alterations in cell wall biosynthesis or cytoskeletal organization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying how genetic knockdowns or small molecules affect cell wall integrity.
- Operational Value: Enables phenotypic screening of compounds that alter mechanical properties as a proxy for lethal target engagement.
- Predictive Value: Stiffness changes serve as early biomarkers of target vulnerability, supporting go/no-go decisions in lead identification.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, quantifiable force-displacement curves suitable for high-content mechanical phenotyping.
- Reproducibility: Optical trap calibration and linear fitting ensure consistent stiffness measurements across operators and labs.
- Scalability: The method can be adapted to test multiple conditions in parallel using microfluidic flow chambers and automated bead delivery.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Aligns with preclinical models where cell wall-targeting antibiotics are evaluated for mechanism of action.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes bacteriostatic from bactericidal effects by correlating stiffness loss with cell lysis.
- Translational Continuity: Enables cross-validation between in vitro mechanical phenotypes and in vivo efficacy in infection models.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation to lead optimization, providing orthogonal mechanical data to complement biochemical and growth-based assays.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by linking mutants or drugs to specific mechanical outcomes, de-risking targets involved in peptidoglycan synthesis.
- Screening: Delivers quantitative outputs (stiffness in pN/µm) that enable rank-ordering of compounds by biophysical impact.
- Analytics: Generates force-displacement datasets requiring linear regression analysis, enabling statistical comparison of mechanical phenotypes across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by providing a mechanistic basis for predicting how cell wall agents compromise structural integrity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable biophysical platform for screening antimicrobial candidates across Gram-negative pathogens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct physical readouts of cell wall integrity upon target perturbation.
- Operational Value: Ensures assay standardization through trap calibration and bead functionalization protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by filtering compounds with non-specific or weak mechanical effects early in screening.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of leads demonstrating significant stiffness reduction, correlating with target vulnerability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical trapping, microfluidics, and bacterial culture handling.
- Depends on calibrated laser trapping systems and position-sensitive detectors for force measurement.
- Necessitates standardization of cell attachment, bead coating, and growth conditions across teams.
- Adaptation to other bacterial strains may require optimization of surface chemistry and growth inducers.
- Practical limitations include low throughput due to single-cell manipulation and the need for skilled operators to identify suitable filamentous cells.
