Rimozione meccanica della membrana di Corion e Vitellina: un metodo per preparare gli ovociti di Drosophila per l'osservazione diretta

- Inizia con ovociti maturi da ovaie fisse in una soluzione salina. Gli ovociti maturi portano gusci d'uovo costituiti da un corion esterno e da una membrana vitellina interna.

Per rimuovere meccanicamente il corion e la membrana vitellina, posizionare gli ovociti tra le parti smerigliate di due vetrini pretrattati. Muovi il vetrino superiore con movimenti rettilinei avanti e indietro per creare un attrito che fa rotolare gli ovociti.

Ora, sposta il vetrino superiore con una leggera angolazione per far rotolare gli ovociti in un'altra direzione. Evitando movimenti circolari, aumentare questo angolo con incrementi brevi fino a quando la guida superiore non si sposta perpendicolarmente alla guida inferiore. Questo movimento rimuove meccanicamente i corioni e le membrane vitelline, consentendo l'accesso di sonde o coloranti nell'ovocita.

Gli ovociti senza corioni appariranno lunghi e sottili e quelli senza membrane vitelline avranno estremità appuntite. Per separare gli ovociti eliminati dai detriti circostanti, trasferire la miscela del campione in una provetta e lasciare che gli ovociti si depositino sul fondo mentre i detriti galleggiano in alto e possono essere rimossi.

In questo protocollo, rimuoveremo le membrane corion e vitellina da ovociti maturi di Drosophila.

- Per separare gli ovociti in fase avanzata, per prima cosa, aggiungi 1 millilitro di PBSBTx in un piatto di dissezione poco profondo. Quindi, utilizzare un P200 con punta rivestita in BSA per trasferire le ovaie fisse nel piatto poco profondo. Pipettare le ovaie su e giù con la punta della pipetta rivestita di BSA per rimuovere gli ovociti maturi dagli ovociti meno maturi.

Quando gli ovociti in fase avanzata sono sufficientemente separati, trasferire tutto il tessuto in una provetta microfuge da 500 microlitri. Rimuovere il liquido in eccesso con una pipetta Pasteur tirata, lasciando circa 150-200 microlitri nel tubo.

Per preparare il rotolamento degli ovociti, pre-bagnare un piatto a pozzetti profondi con 200 microlitri di PBSBTx. Coprire il piatto e metterlo da parte.

Procuratevi tre vetrini smerigliati e mettetene da parte tre. Quindi, strofinare delicatamente le regioni di vetro smerigliato dei vetrini uno e due. Sciacquateli in acqua deionizzata per rimuovere eventuali schegge di vetro e asciugateli con una salvietta usa e getta. Rivestire le regioni smerigliate dei vetrini uno e due con PBSBTx aggiungendo 50 microlitri di PBSBTx a un vetrino e strofinando questa regione con l'altro vetrino. Rimuovere il liquido con una salvietta monouso e posizionare i vetrini sotto un microscopio da dissezione. Tenere le regioni smerigliate delle diapositive uno e due a contatto con la diapositiva tre che supporta la diapositiva due.

Per arrotolare gli ovociti, per prima cosa, pre-inumidire un puntale per pipetta P200 in PBSBTx e disperdere gli ovociti nella provetta per microfughe pipettando su e giù. Trasferire 50 microlitri di liquido contenente gli ovociti al centro della parte in vetro smerigliato del vetrino uno. Sollevare la diapositiva due per fare ciò.

Abbassare lentamente il diapositive due fino a quando la tensione superficiale del liquido crea una tenuta tra le due regioni di vetro smerigliato. Dovrebbe esserci abbastanza liquido per coprire l'area ghiacciata, ma non dovrebbe fuoriuscire. Quindi, tenere la diapositiva inferiore in posizione con una mano e utilizzare l'altra mano per spostare la diapositiva superiore due avanti e indietro in direzione orizzontale, mantenendo la diapositiva due in piano e supportata dalla diapositiva tre.

Eseguire al microscopio per una facile visualizzazione dei movimenti e dei progressi degli ovociti. Dopo alcuni movimenti in direzione orizzontale, modificare leggermente l'angolo di movimento. Con incrementi multipli, aumentare gradualmente questo angolo fino a 90 gradi fino a quando il movimento della slitta superiore due è perpendicolare alla direzione iniziale. Si noti che i corioni vuoti saranno visibili nel liquido e gli ovociti privi di corioni appariranno più lunghi e più sottili.

- Quando si arrotolano gli ovociti, assicurarsi che la direzione di rotolamento sia sempre in linea retta e mai con un movimento circolare.

- Ripetere l'arrotolamento circa 7-10 volte fino a quando la soluzione diventa leggermente torbida. Smetti di rotolare quando la maggior parte degli ovociti sembra aver perso le membrane vitelline.

Sollevare delicatamente il vetrino superiore due, trascinando uno dei suoi angoli al centro della regione glassata in quello inferiore in modo che gli ovociti arrotolati si accumulino al centro della regione ghiacciata. Sciacquare gli ovociti di entrambi i vetrini con PBSBTx nella capsula a pozzetti profondi contenente PBSBTx.

Pulire i vetrini uno e due con acqua ultrapura. Asciugare con una salvietta usa e getta e ripristinare. Ripetere questi passaggi fino a quando tutti gli ovociti dello stesso genotipo sono stati arrotolati. Questo di solito richiede da tre a quattro cicli di laminazione per genotipo.

Per rimuovere i detriti dopo il rotolamento, aggiungere 1 millilitro di PBSBTx a un tubo conico da 15 millilitri. Agitare il liquido per ricoprire i lati del tubo. Utilizzando un puntale per pipetta P1000 rivestito di PBSBTx, trasferire gli ovociti arrotolati dalla capsula a pozzetti profondi alla provetta conica contenente 1 millilitro di PBSBTx. Aggiungere altri 2 millilitri di PBSBTx alla provetta conica contenente gli ovociti.

Tieni la tuba conica su uno sfondo scuro per vedere gli ovociti opachi mentre affondano. Dopo aver lasciato che gli ovociti si depositino sul fondo, utilizzare un P1000 per rimuovere i 2 millilitri superiori di soluzione contenente detriti e gettarli.

Dopo aver ripetuto il passaggio per un totale di tre cicli di rimozione dei detriti, utilizzare una punta per pipetta P1000 rivestita in PBSBTx per trasferire gli ovociti nella provetta originale per microfugi da 500 microlitri. Da 20 a 25 femmine dovrebbero produrre circa 50 microlitri di ovociti maturi arrotolati.