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- Quando si visualizzano le goccioline lipidiche, gli organelli di stoccaggio intracellulare per i lipidi neutri, iniziano aggiungendo al campione una soluzione detergente, come quella contenente Triton X-100. Questo permeabilizzerà le cellule del verme. Quindi, fissare il campione nella concentrazione appropriata di isopropanolo, ad esempio il 40%.
Quindi, aggiungi il rosso del Nilo al campione e proteggilo dalla luce, poiché il colorante è sensibile alla luce. La fissazione consente al colorante di accedere alle goccioline lipidiche in tutto l'animale. Il rosso del Nilo è un colorante lipofilo il cui spettro di emissione della fluorescenza dipende dalla polarità dell'ambiente lipidico locale.
Se esposto a lipidi polari, come i fosfolipidi, lo spettro di emissione del rosso Nilo si trova nelle lunghezze d'onda rosse più elevate. Se esposto a lipidi neutri, come i triacilgliceroli e gli esteri sterolici nel nucleo neutro delle goccioline lipidiche, lo spettro di emissione del rosso Nilo si sposta verso le lunghezze d'onda più basse, quelle giallo-oro.
Pertanto, utilizzare il canale verde di un microscopio a fluorescenza, che raccoglierà le emissioni di lunghezza d'onda giallo-oro, per visualizzare la colorazione con rosso Nilo delle goccioline lipidiche in tutto l'animale. Nel protocollo di esempio, vedremo una procedura di colorazione del rosso del Nilo e l'imaging di goccioline lipidiche in campioni fissati.
- Per eseguire la colorazione lipidica del rosso del Nilo, placcare i vermi sul terreno di crescita dei nematodi, o NGM, seminare con il tronco tardivo OP50 E. coli, e far crescere i vermi a 20 gradi Celsius fino allo stadio L4 iniziale. Lavare i vermi con 1 millilitro di soluzione PBST e trasferire la sospensione di vermi in un tubo per microfughe da 1,5 millilitri.
Centrifugare i vermi a 560 volte la gravità per un minuto, quindi rimuovere il surnatante e ripetere il lavaggio PBST fino a quando l'E. coli non viene eliminato dalla sospensione. Successivamente, al pellet di verme, aggiungere 100 microlitri di isopropanolo al 40%, o al 60% per la colorazione ORO, e incubare il campione a temperatura ambiente per tre minuti.
- L'aggiunta di isopropanolo è fondamentale per una corretta permeabilizzazione dei vermi prima della colorazione.
- Centrifugare i vermi a 560 volte la gravità per un minuto e rimuovere il surnatante senza rompere il pellet del verme.
- È importante ridurre al minimo l'esposizione alla luce durante le fasi di centrifugazione.
- Ora, mentre si è al buio, aggiungere 600 microlitri di soluzione di lavoro NR precedentemente preparata a ciascun campione. Capovolgere le provette tre volte e mescolare completamente le viti senza fine e la soluzione. Quindi incubare il campione al buio a temperatura ambiente per due ore.
Dopo l'incubazione, centrifugare i vermi e rimuovere il surnatante. Quindi aggiungere 600 microlitri di PBST e incubare i campioni al buio per 30 minuti per rimuovere la colorazione NR in eccesso. Dopo aver centrifugato nuovamente i campioni come prima, rimuovere tutti i microlitri di surnatante tranne circa 50 microlitri.