0 visualizzazioni • 3:15 min. • April 30th, 2023
- Per iniziare, aggiungere carbenicillina e un millimolare di IPTG per controllare e testare i flaconi di coltura contenenti terreno basale S. Centrifugare un tubo contenente le larve nella prima fase di crescita, chiamate anche larve L1, per alcuni minuti. Ora rimuovi il surnatante e metti due microlitri di L1 su una piastra di agar. Posizionare la piastra sotto un microscopio da dissezione e contare il numero di larve.
Aggiungere i batteri RNAi che trasportano un plasmide RNAi non specifico al pallone di controllo e i batteri con RNAi mirato al gene nel pallone di prova. La quantità di batteri aggiunti dovrebbe essere proporzionale al numero di vermi.
Lasciare crescere le larve agitando continuamente per garantire una corretta ossigenazione. Le larve si nutrono dei batteri. All'interno della larva, il piccolo RNA interferente si lega all'mRNA complementare prodotto dal gene bersaglio e inibisce l'espressione proteica. Infine, esamina i vermi per il tuo fenotipo di interesse.
Nel protocollo di esempio, tratteremo larve di L1 con RNAi che ha come bersaglio il gene daf-2, in coltura liquida.
- Per iniziare il trattamento, aggiungere 207,45 millilitri di terreno basale S con reagenti aggiuntivi come descritto nel protocollo di testo allegato a un pallone di coltura Fernbach da 2.800 millilitri. Aggiungere una concentrazione finale di 50 microgrammi per millilitro di carbenicillina e 1 millimolare di IPTG e chiudere il pallone con un tappo a vite a membrana.
Estrarre gli L1 dall'incubatrice a 25 gradi Celsius e trasferirli in provette da 15 millilitri. Centrifugare gli L1 a 1.900 volte g per tre minuti. Dopo la centrifuga, rimuovere il surnatante. Al microscopio, contare gli L1 per due microlitri e fare la media dei numeri ottenuti da almeno nove gocce.
Successivamente, aggiungere 50.000 vermi per la raccolta di vermi giovani e 100.000 vermi per la raccolta di vermi invecchiati in quattro fiasche di coltura Fernbach preparate nel passaggio precedente. Quindi aggiungere i batteri RNAi di controllo e i batteri RNAi per il gene di interesse proporzionalmente al numero di vermi.
Dopo aver aggiunto i batteri, completare la coltura di vermi con S basale per portare il volume totale a 300 millilitri. Incubare la coltura di vermi a 25 gradi Celsius in un'incubatrice vibrante a 150 giri/min fino alla raccolta.