Alimentazione dell'RNAi in coltura liquida: un metodo ad alto rendimento per abbattere l'espressione genica in C. elegans

- Per iniziare, aggiungere carbenicillina e un millimolare di IPTG per controllare e testare i flaconi di coltura contenenti terreno basale S. Centrifugare un tubo contenente le larve nella prima fase di crescita, chiamate anche larve L1, per alcuni minuti. Ora rimuovi il surnatante e metti due microlitri di L1 su una piastra di agar. Posizionare la piastra sotto un microscopio da dissezione e contare il numero di larve.

Aggiungere i batteri RNAi che trasportano un plasmide RNAi non specifico al pallone di controllo e i batteri con RNAi mirato al gene nel pallone di prova. La quantità di batteri aggiunti dovrebbe essere proporzionale al numero di vermi.

Lasciare crescere le larve agitando continuamente per garantire una corretta ossigenazione. Le larve si nutrono dei batteri. All'interno della larva, il piccolo RNA interferente si lega all'mRNA complementare prodotto dal gene bersaglio e inibisce l'espressione proteica. Infine, esamina i vermi per il tuo fenotipo di interesse.

Nel protocollo di esempio, tratteremo larve di L1 con RNAi che ha come bersaglio il gene daf-2, in coltura liquida.

- Per iniziare il trattamento, aggiungere 207,45 millilitri di terreno basale S con reagenti