Name: One-step Metabolomica: carboidrati, acidi organici e aminoacidi quantificati in una procedura unica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-25T17:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Scopri la metabolomica one-step per analizzare carboidrati, acidi organici e aminoacidi con GC/MS in un'unica procedura. Questo metodo migliora lo screening neonatale per errori congeniti del metabolismo.

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L&#39;assistenza tecnica in grado di Anthony Thomas Si ringrazia.

Procedura per l&#39;elaborazione campioni di urina <ol><li> Scongelare il campione di urina in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. Decantare in un nuovo contenitore se l&#39;originale è compromessa. </li><li> Prendete un aliquota massima di 13 ml di campione e conservarlo a -20 ° C in una provetta per centrifuga coniche. </li><li> Misurare e registrare la densità ottica del campione mettendo un paio di gocce di urina nel rifrattometro. </li><li> Filtrare il campione attraverso un filtro da 0,2 um. </li><li> Misurare il volume del campione al di sotto in base alla densità ottica <table border="0"><tbody><tr><td> 1,000-1,009 </td><td> 1,00 ml </td></tr><tr><td> 1,010-1,019 </td><td> 0,50 ml </td></tr><tr><td> 1,020-1,050 </td><td> 0,25 ml + 0,25 ml di H 2 O </td></tr></tbody></table></li><li> Il volume specificato non è poi trasferito in un Reactivial contenente le seguenti norme interne: 500 nanomoli (nmoli) 3 Creatina, 10 nmoli d 3 acido metilmalonico, 100 nmoli ciascuno dei seguenti 13 C 3 lattato, 13 C 3 piruvato, 13 C 2 15 N glicina, serina d 3, d 5 fenilalanina, D 11 hexanoylglycine, 15 N 2 orotato, d 4 acido sebacico, 13 C 6 glucosio, d 6 inositolo e d 5 triptofano. </li><li> 20 microlitri (microlitri) di un 7,5 Unità / ul di soluzione di ureasi (Calzyme catalogo Laboratori no. 116A0100) viene aggiunto al campione, che viene poi lavata e sigillato in CO 2 attraverso un setto inerte. </li><li> Il campione è a 37 ° C per 30 minuti con il gas di biossido di carbonio aggiunto a intervalli di 15 minuti per mantenere la pressione. </li><li> 20 l più della soluzione di ureasi si aggiunge, il flacone viene lavata con l&#39;anidride carbonica, e il campione mantenuto a 37 ° C per altri 15 minuti. </li><li> 500 ml di acetone 30:70: metanolo viene aggiunto, il setto di gomma viene sostituito con un setto rivestito in teflon, e il campione viene raffreddato a -20 ° C per 15 minuti. </li><li> Solidi vengono rimossi mediante centrifugazione a 1500 rpm x 10 minuti, poi travasata in un ambiente pulito 2,0 cc Reactivial (Supelco / Sigma) </li><li> Aggiungi trifluoroacetato triethylammonium (TEA / TFA) (Sigma) come segue: <ul><li> 20 l per 1,00 ml campioni </li><li> 40 microlitri per 0,5 ml, o meno, i campioni </li></ul></li><li> Top fuori con acetonitrile e di luogo in un flusso di azoto a 70 ° C fino a volume costante si ottiene (TEA / TFA rimarrà) (~ 15 minuti). </li><li> Ripetere il passaggio 13, fino a 4 volte fino a quando si forma un precipitato (~ 10 minuti ciascuno). </li><li> Lasciate raffreddare per circa 2 minuti. Top fuori con cloruro di metilene, facendo attenzione di ebollizione, e secco (~ 4:00 minuti). </li><li> Ripetere il punto 15. </li><li> Aggiungi MSTFA (N-metil-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide) (termica scientifico) alle seguenti tariffe: <ul><li> 150 microlitri per 1,00 ml campioni </li><li> 200 ul per 0,50 ml, o meno, i campioni </li></ul></li><li> Cap in atmosfera di azoto e incubare a 70 ° C per 1 ora. </li><li> Trasferimento a microprovette, in atmosfera di azoto, per l&#39;analisi dei gas cromatografo / spettrometro di massa. </li><li> Microprovette posto per l&#39;iniezione automatizzato dal 5975 Agilent GC / MS: le temperature dello strumento sono: iniettore 200 ° C, l&#39;interfaccia di 250 ° C, forno a 80 ° C per 1 minuto; rampa a 4 ° C / minuto 80-130 ° C, rampa 6 ° C / minuto 130-200 ° C, rampa a 12 ° C / minuto 200-285 ° C, mantenere per 10 minuti. Colonna: 25 m, 320 micron ID, spessore 0.5 micron DB-5. Mass Spec: fonte 230 ° C, quad 150 ° C, Scansione 50-650 amu a 2,46 scansioni / sec. Solvente pausa di 3,5 minuti. </li></ol> Rappresentante Risultati Si prega di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2014/ShoemakerResultHawkinsinuria.pdf">cliccare qui</a> per vedere i risultati rappresentativi.

<ol><li>Shoemaker, J. D., Elliott, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+screening+of+urine+samples+for+carbohydrates%2C+organic+and+amino+acids+after+treatment+with+urease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Automated screening of urine samples for carbohydrates, organic and amino acids after treatment with urease.</a> J. Chromatogr. 562 (1-2), 125-138 (1991).</li>
<li>Kuhara, T., Shinka, T., Inoue, Y., Ohse, M., Zhen-wei, X., Yoshida, I., Inokuchi, T., Yamaguchi, S., Takayanagi, M., Matsumoto, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pilot+study+of+gas+chromatographic-mass+spectrometric+screening+of+newborn+urine+for+inborn+errors+of+metabolism+after+treatment+with+urease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Pilot study of gas chromatographic-mass spectrometric screening of newborn urine for inborn errors of metabolism after treatment with urease.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 731 (1), 141-147 (1999).</li>
<li>Fu, X., Iga, M., Kimura, M., Yamaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+screening+for+organic+acidemia+using+GC%2FMS+and+dried+urine+filter+paper%3A+a+study+on+neonatal+mass+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Early+Hum+Dev%22%5BJournal%5D)">Simplified screening for organic acidemia using GC/MS and dried urine filter paper: a study on neonatal mass screening.</a> Early Hum Dev. 58 (1), 41-55 (2000).</li>
<li>Kuhara, T., Ohdoi, C., Ohse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+gas+chromatographic-mass+spectrometric+procedure+for+diagnosing+pyrimidine+degradation+defects+for+prevention+of+severe+anticancer+side+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Simple gas chromatographic-mass spectrometric procedure for diagnosing pyrimidine degradation defects for prevention of severe anticancer side effects.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758 (1), 61-74 (2001).</li>
<li>Kuhara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+inborn+errors+of+metabolism+using+filter+paper+urine%2C+urease+treatment%2C+isotope+dilution+and+gas+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of inborn errors of metabolism using filter paper urine, urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758, 3-25 (2001).</li>
<li>Iga, M., Kimura, M., Ohura, T., Kikawa, Y., Yamaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+simplified+and+sensitive+method+for+screening+fructose-1%2C6-diphosphatase+deficiency+by+analyzing+urinary+metabolites+in+urease%2Fdirect+preparations+and+gas+chromatography-mass+spectrometry+in+the+selected-ion+monitoring+mode%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Rapid, simplified and sensitive method for screening fructose-1,6-diphosphatase deficiency by analyzing urinary metabolites in urease/direct preparations and gas chromatography-mass spectrometry in the selected-ion monitoring mode.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 746 (1), 75-82 (2000).</li>
<li>Kuhara, T., Ohse, M., Ohdoi, C., Ishida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+diagnosis+of+homocystinuria+by+urease+treatment%2C+isotope+dilution+and+gas+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Differential diagnosis of homocystinuria by urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 742 (1), 59-70 (2000).</li>
<li>Validation and Extension of the Urease Method for Urine Organic and Amino Acid Analysis. Young, V., Lo, S., Shoemaker, J., Thomas, A., Rhead, W. Society for Inherited Metabolic Disorders Annual Meeting, 2008 Mar, Asilomar, California, , (2008).</li>
<li>Smith, E. M., Hoi, J. T., Eissenberg, J. C., Shoemaker, J. D., Neckameyer, W. S., Ilvarsonn, A. M., Harshman, L. G., Schlegel, V. L., Zempleni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding+Drosophila+a+biotin-deficient+diet+for+multiple+generations+increases+stress+resistance+and+lifespan+and+alters+gene+expression+and+histone+biotinylation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Feeding Drosophila a biotin-deficient diet for multiple generations increases stress resistance and lifespan and alters gene expression and histone biotinylation patterns.</a> J Nutr. 137 (9), 2006-2012 (2007).</li>
<li>Brown, S. M., Shoemaker, J. D., Lodge, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Importance+of+NADP%2B-Dependent+Isocitrate+Dehydrogenase+in+Resistance+to+Nitrosative+Stress+and+the+Inessentiality+of+Glucose-6-Phosphate+Dehydrogenase+for+Oxidative+Stress+Resistance+in+Cryptococcus+neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">The Importance of NADP+-Dependent Isocitrate Dehydrogenase in Resistance to Nitrosative Stress and the Inessentiality of Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase for Oxidative Stress Resistance in Cryptococcus neoformans.</a> Eukaryotic Cell. , (2010).</li>
<li>Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+Screening+in+Humans+by+Gas+Chromatography-Mass+Spectrometry+of+Urine+Metabolites+After+Substrate+Loading%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Nutritional Screening in Humans by Gas Chromatography-Mass Spectrometry of Urine Metabolites After Substrate Loading.</a> , (1992).</li>
<li>Baggot, P. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valproate-induced+biochemical+abnormalities+in+pregnancy+corrected+by+vitamins%3A+A+Case+Report%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Valproate-induced biochemical abnormalities in pregnancy corrected by vitamins: A Case Report.</a> Epilepsia. 40 (44), 512-515 (1999).</li>
<li>Baggot, P. J., Eliseo, A. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+folate-dependent+metabolite+in+amniotic+fluid+from+pregnancies+with+normal+or+trisomy+21+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Fetal+Diagn+Ther%22%5BJournal%5D)">A folate-dependent metabolite in amniotic fluid from pregnancies with normal or trisomy 21 chromosomes.</a> Fetal Diagn Ther. 21 (1), 148-152 (2006).</li>
<li>Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organic+acid+concentrations+in+amniotic+fluid+found+in+normal+and+Down+syndrome+pregnancies%5BTitle%5D)+AND+%22Fetal+Diagn+Ther%22%5BJournal%5D)">Organic acid concentrations in amniotic fluid found in normal and Down syndrome pregnancies.</a> Fetal Diagn Ther. 23 (3), 245-248 (2008).</li>
<li>Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyridoxine-related+metabolite+concentrations+in+normal+and+Down+syndrome+amniotic+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Fetal+Diagn+Ther%22%5BJournal%5D)">Pyridoxine-related metabolite concentrations in normal and Down syndrome amniotic fluid.</a> Fetal Diagn Ther. 23 (4), 254-257 (2008).</li>
</ol>

Il Laboratorio di Screening metabolica è una CLIA con licenza laboratori clinici di proprietà della Saint Louis University, un&#39;organizzazione non-profit. Dr. Shoemaker non un beneficio diretto dal fatturato di laboratorio, ma può beneficiare indirettamente la produttività del laboratorio. Nessuno dei metodi, tecniche, risultati, gamma normale, macro, il software, le librerie o le conclusioni sono considerati di proprietà e sono liberamente a disposizione degli interessati.

Il metodo di ureasi (1) è stato citato 62 volte nella letteratura medica con varie modifiche. Gruppo di Matsumoto (2,3) ha semplificato la procedura per l&#39;high-throughput screening neonatale e riportato i risultati da 16000 pazienti. Kuhara e altri (4-7) hanno riportato l&#39;utilizzo del metodo in diversi casi di diagnosi degli errori congeniti e follow-up. Rhead (8) ha confermato l&#39;utilità del metodo per la diagnosi clinica e follow-up di errori congeniti. Il metodo è stato applicato a urina di orsi, topi knock-out, elefanti e omogenati di mosche frutti interi e le loro larve (9). Terreni di coltura da Cryptococcus prima e dopo la mutagenesi sito-diretta sono stati analizzati, senza il passaggio ureasi (10). Il metodo è stato applicato per la valutazione dei nutrizionale studenti di medicina, pazienti con sindrome di Down e anziani dementi veterani dopo aver caricato i soggetti con dosi orali degli aminoacidi triptofano, metionina ed isoleucina (11). Tutti gli otto vitamine del gruppo B sono stati valutati da quantificare il prodotti di degradazione dei tre aminoacidi che, tra i quali, che tutte le 8 vitamine ad un certo punto della loro degradazione. Gli effetti tossici dei farmaci e la loro mitigazione da supplementazione di vitamina è stata riportata (12). Campioni di liquido amniotico da gravidanze normali e sindrome di Down sono stati analizzati e riportati (13-15).

<table><tbody><tr><td>MSD 5975</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>GC/MS/Computer</td></tr><tr><td>MSD 5973</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>GC/MS/Computer</td></tr><tr><td>Ureasi</td><td>Calzyme</td><td>116A0100</td><td>Disponibile anche da Sigma C3</td></tr><tr><td>Standard di Isotopi Stabili</td><td>CDN Isotopes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solventi</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analiti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colonne GC</td><td>J&amp;amp;W Scientific</td><td>123-5026</td><td></td></tr><tr><td>TEA/TFA</td><td>Fluka</td><td>09747</td><td></td></tr><tr><td>Vial</td><td>Supelco, Sigma-Aldrich</td><td>Z115088/12EA</td><td></td></tr><tr><td>Merlin Microseal</td><td>Agilent Technologies</td><td>5181-8815</td><td></td></tr><tr><td>MSTFA</td><td>Thermal Scientific, Inc.</td><td>48913</td><td></td></tr></tbody></table>

one-step metabolomica: carboidrati, acidi organici e aminoacidi quantificati in una procedura unica

One-step Metabolomics: Carbohydrates, Organic and Amino Acids Quantified in a Single Procedure

Ogni bambino nato negli Stati Uniti è ora proiettato fino a 42 malattie rare genetiche chiamate &quot;errori congeniti del metabolismo&quot;. Il metodo di screening si basa sulla spettrometria di massa tandem e quantifica acilcarnitine come schermo per acidemias organici e misure anche aminoacidi. Tutti gli stati anche eseguire il test enzimatico per i disturbi di carboidrati come la galattosemia. Perché i risultati possono essere non specifici, test di follow-up dei risultati positivi è necessario utilizzare un metodo più definitiva. La presente relazione descrive il metodo &quot;ureasi&quot; di preparazione dei campioni per lo screening errore congenito. Enzima ureasi cristallino è utilizzato per rimuovere l&#39;urea da fluidi corporei che permette maggior parte degli altri metaboliti solubili in acqua da disidratare e derivatizzati per gascromatografia in un unico procedimento. Disidratazione per evaporazione in corrente di azoto è facilitato con l&#39;aggiunta di acetonitrile e cloruro di metilene. Poi, trimethylsilylation avviene in presenza di un unico catalizzatore, trifluoroacetato triethylammonium. Iniezione automatizzato e cromatografia è seguito da macro-driven quantificazione usanza di 192 metaboliti e semi-quantificazione di ogni componente principale utilizzando librerie specializzate di spettri di massa di TMS derivatizzati composti biologici. L&#39;analisi può essere eseguita sul ampiamente utilizzato piattaforma Chemstation utilizzando le macro e librerie disponibili da parte dell&#39;autore. Nel nostro laboratorio, oltre 16.000 campioni di pazienti sono stati analizzati utilizzando il metodo con una resa diagnostica di circa il 17% - vale a dire il 17% dei campioni risultati rivelano che i risultati dovrebbero essere attuate da parte del medico di ordinazione. Inclusi in queste oltre 180 sono gli errori confermata congeniti, di cui circa il 38% non avrebbe potuto essere diagnosticata con metodi precedenti.

Il metodo ureasi di preparazione dei campioni per GC / MS dei metaboliti di intermediazione è presentato dal suo inventore. Il metodo permette di one-step di follow-up di screening neonatale per errori congeniti mediante spettrometria di massa tandem dai carboidrati quantificazione, organici e aminoacidi tutti in un unico processo.

One-step Metabolomica: carboidrati, acidi organici e aminoacidi quantificati in una procedura unica

Ogni neonato negli Stati Uniti viene ora sottoposto a screening per arrivare a 42 rari disturbi genetici denominati "errori congeniti del metabolismo". Il metodo di screening si basa su...

In questa procedura metabolomica in un unico passaggio, i campioni biologici vengono preparati per l'analisi di carboidrati, acidi organici e aminoacidi mediante spettrometria di massa accoppiata a cromatografia gassosa in un'unica procedura. I campioni vengono innanzitutto trattati con l'enzima ureasi per rimuovere l'urea. Il secondo passaggio della procedura consiste nel disidratare i campioni in presenza di un detergente composto da due componenti volatili, triatione, ammonio e trifluoroacetato.Successivamente, i componenti vengono sottoposti a derivatizzazione mediante trimetilazione. Infine, l'analisi mediante cromatografia gassosa e spettrometria di massa, insieme alla quantificazione automatizzata di carboidrati, acidi organici e aminoacidi, isol, glicina e amminozuccheri, consente la conferma e il monitoraggio della maggior parte dei disturbi genetici individuati tramite lo screening neonatale, nonché di un ulteriore 38% di disturbi attualmente non ricercati con spettrometria di massa in tandem. Salve, sono Jim Shoemaker del Laboratorio di Screening Metabolico della St. Louis University.Sono qui per dimostrare la metabolomica in un unico passaggio, un metodo per analizzare i fluidi biologici alla ricerca di metaboliti intermedi senza separare composti acidi, basici e neutri. Questo consente di effettuare un controllo successivo allo screening neonatale mediante spettrometria di massa in tandem con un'unica procedura che permette di analizzare acidi organici, aminoacidi, carboidrati, derivati dei carboidrati e glicina ACell in un solo passaggio. Il risultato è che, nel grafico alle mie spalle, si può osservare come le diagnosi in rosso possano essere effettuate mediante la metabolomica in un unico passaggio, ma non sarebbero state rilevate con lo screening neonatale attuale basato sulla spettrometria di massa in tandem.Iniziamo la dimostrazione. Per iniziare questa procedura, riscaldare il campione di urina in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Se il contenitore originale è compromesso, trasferire un campione in un contenitore nuovo.Prelevare un'aliquote del campione e conservarla a meno 20 gradi Celsius in un tubo conico per centrifuga etichettato come riserva. Successivamente, misurare e registrare la densità ottica del campione posizionando alcune gocce di urina nel rifrattometro portatile. Dopo aver misurato la densità ottica, filtrare il campione attraverso un filtro da 0,2 micron.Misurare il volume del campione in base alla densità ottica misurata prima della filtrazione. Per valori compresi tra 1 e 1,009, utilizzare un millilitro di campione; per valori compresi tra 1,01 e 1,019, utilizzare 0,5 millilitri di campione; per valori compresi tra 1,02 e 1,05, combinare 0,25 millilitri di campione con 0,25 millilitri di acqua.Trasferire il volume specificato in una provetta reattiva che contiene già gli standard interni marcati con isotopi specificati nella tabella mostrata qui. Gli standard includono creatina, acido metilmalonico, lattato, piruvato, glicina, sine fenilalanina, esaidrossibenzene, glicina, orato, acido SEBA, glucosio, inositolo e triptofano. Aggiungere quindi 20 microlitri di una soluzione di ureasi a 7,5 unità per microlitro.Svuotare il campione e sigillare sotto anidride carbonica attraverso un setto inerte. Mantenere il campione a 37 gradi Celsius per 30 minuti, aggiungendo ulteriore gas anidride carbonica a intervalli di 15 minuti per mantenere la pressione, alla fine dell'incubazione di 30 minuti, di 20 microlitri in più della soluzione di ureasi. Svuotare il vial con anidride carbonica e mantenere il campione a 37 gradi Celsius per altri 15 minuti.Una volta completato il trattamento con ureasi, procedere immediatamente alla disidratazione e alla derivatizzazione del campione subito dopo il trattamento con ureasi. Aggiungere 500 microlitri di una soluzione di acetone metanolo da 30 a 70. Ai campioni, sostituire il setto di gomma con un setto rivestito in teflon.Raffreddare il campione a meno 20 gradi Celsius per 15 minuti. Rimuovere i solidi mediante centrifugazione a 1500 giri al minuto per 10 minuti, quindi trasferire il soprannatante in una provetta reattiva pulita da 2,0 mL. Aggiungere quindi triammonio trifluoroacetato o T-E-A-T-F-A, che è il catalizzatore per la trimetilazione: 20 microlitri per campioni di un millilitro e 40 microlitri per campioni di 0,5 millilitri o inferiori.Completare con acetonitrile e porre sotto un flusso di azoto a 70 gradi Celsius fino al raggiungimento di un volume costante, indicativo della presenza residua di T-E-A-T-F-A. Questo richiede circa 15 minuti. Nuovamente, completare con acetonitrile e porre sotto un flusso di azoto a 70 gradi Celsius fino al raggiungimento di un volume costante, ripetendo fino a quattro volte fino a quando si forma un precipitato.Questa operazione richiede circa 10 minuti ogni volta dopo la disidratazione; lasciare raffreddare per circa due minuti. Completare con cloruro di metilene, facendo attenzione al traboccamento durante l'ebollizione, quindi asciugare. Questa fase richiede circa quattro minuti.Completare con cloruro di metilene ed essiccare. Un'ultima volta. Successivamente, derivatizzare il campione.Aggiungere 150 microlitri di OFM, STFA per campioni di un millilitro e 200 microlitri per 0,5 millilitri o meno. Chiudere i campioni sotto atmosfera di azoto e incubare a 70 gradi Celsius per un'ora. Al termine dell'incubazione di un'ora, lavorare sotto atmosfera di azoto per trasferire i campioni in vial microscopici per l'analisi mediante cromatografo gascromatografico-spettrometro di massa; in questo caso viene utilizzato l'Agilent 5 9 7 5 GCMS con una colonna capillare DB cinque.Per lo spettrometro di massa, impostare la sorgente a 230 gradi Celsius, il quadrupolo a 150 gradi Celsius e l'intervallo di massa di scansione da 50 a 650 u.m.a. a 2,46 scansioni al secondo. Il ritardo del solvente è di 3,5 minuti. Le temperature dello strumento sono di 200 gradi Celsius per l'iniettore e di 250 gradi Celsius. Per l'interfaccia, impostare il forno a 80 gradi Celsius per un minuto, quindi aumentare di quattro gradi Celsius al minuto da 80 a 130 gradi Celsius, dopodiché aumentare di sei gradi Celsius al minuto da 130 a 200 gradi Celsius, e infine aumentare di 12 gradi Celsius al minuto da 200 a 285 gradi Celsius, mantenendo costante per 10 minuti. Posizionare le micro provette contenenti i campioni derivati da occhio per l'iniezione automatizzata da parte del GCMS e avviare l'analisi. Qui viene mostrato uno spettro rappresentativo di un campione di urina analizzato mediante GCMS dopo il trattamento con ureasi, con i picchi corrispondenti ai metaboliti acido pirroglutammico, acido 4-idrossicicloacetico e hawkinson marcati.Questi metaboliti sono indicativi di Anuria di Hawkins, un disturbo genetico raro. Tutti i picchi nello spettro possono essere attribuiti a metaboliti noti e quantificati. I risultati dei test iniziali di screening neonatale possono essere aspecifici.Tuttavia, i livelli elevati di metaboliti dell'UR di Hawkins nel campione di urina analizzato mediante GCMS, come mostrato qui, hanno confermato la diagnosi di questa malattia congenita del metabolismo. Utilizzando lo stesso metodo URIs, sono stati diagnosticati difetti congeniti in 184 pazienti. Quasi il 40% delle diagnosi indicate in rosso non sarebbe stato individuato mediante spettrometria di massa in tandem comunemente utilizzata nello screening neonatale.Questa è quindi la nostra dimostrazione su come eseguire una metabolomica in un unico passaggio utilizzando il metodo dell'ureasi per analizzare fluidi biologici per carboidrati, acidi organici e amminoacidi, e acil glicina, tutti nella stessa procedura. È importante ricordare che, quando si valuta l'efficacia della procedura, la digestione con ureasi, la disidratazione e la simulazione con trimetil possono essere tutte valutate per verificarne la completezza, semplicemente controllando la presenza di tutti gli standard interni.Gli standard interni sono stati scelti deliberatamente per dimostrare, ad esempio, che la disidratazione è andata a completezza, poiché in caso contrario la creatinina TRI TMS non sarebbe stata presente nella quantità totale. Questa è quindi la nostra dimostrazione. Se siete interessati ai macro e alle librerie che abbiamo sviluppato per interpretare questa procedura utilizzando ChemStation, inviatemi un'e-mail all'indirizzo mostrato sul vostro schermo; ulteriori informazioni sul nostro laboratorio sono disponibili all'URL visualizzato sullo schermo.Grazie mille. Sono Jim Shoemaker.

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Multi-step di preparazione tecnica per recuperare più classi di composti metabolita di approfondita analisi e Metabolomica informativo

Interazioni proteina-proteina e proteina-metabolita sono cruciali per tutte le funzioni cellulari. Qui, descriviamo un protocollo che permette l'analisi parallela di queste interazioni con una proteina di scelta. Il nostro protocollo è stato ottimizzato per colture di cellule vegetali e combina purificazione di affinità con proteina basati sulla spettrometria di massa e rilevamento di metabolita.

2 in 1: purificazione di affinità per l'analisi parallela di proteina-proteina e proteina-metabolita complessi in un unico passaggio

Questo protocollo descrive un singolo throughput per complementari tecniche analitiche e omiche che culmina in una caratterizzazione completamente accoppiato di sostanza organica naturale e proteomica microbica in ecosistemi differenti. Questo approccio permette confronti robusti per identificare vie metaboliche e trasformazioni importanti per descrivere la produzione di gas serra e predire le risposte al cambiamento ambientale.

Singolo-velocità effettiva complementari ad alta risoluzione tecniche analitiche per la caratterizzazione di miscele complesse di sostanza organica naturale

Lo scopo di questo articolo è quello di descrivere un protocollo per l'estrazione di metaboliti acquosi da cellule aderenti coltivate per l'analisi metabolomica, in particolare, elettroforesi capillare-spettrometria di massa.

Estrazione di metaboliti acquosi da cellule aderenti coltivate per l'analisi metabolomica mediante elettroforesi capillare-spettrometria di massa

Qui, presentiamo un protocollo robusto per quantificare 40 composti coinvolti nel metabolismo centrale del carbonio e dell'energia nelle reazioni di sintesi proteica priva di cellule. La miscela di sintesi senza cellule viene derivata con un'anilina per una separazione efficace utilizzando la cromatografia liquida a fase invertita e quindi quantificata dalla spettrometria di massa utilizzando standard interni etichettati isotopicamente.

Quantificazione assoluta del metabolismo della sintesi proteica senza cellule da demografia-cromometria di massa a fase reverse

Viene presentato un metodo per l'analisi non mirata di metaboliti e lipidi di grano. Il protocollo include un metodo di estrazione dei metaboliti dell'acetonitricolo e la metodologia di cromatometria liquida-massa di fase invertita, con l'acquisizione in modalità di ionizzazione elettrospray positive e negative.

Analisi metabolomica a base di cromomia liquida non mirata del grano di grano di grano

Presentiamo un protocollo per l'identificazione e la quantificazione delle principali classi di metaboliti idrosolubili nel lievito Saccharomyces cerevisiae. Il metodo descritto è versatile, robusto e sensibile. Permette la separazione di isomeri strutturali e forme stereoisomeriche di metaboliti idrosolubili l'uno dall'altro.

Metabolomica quantitativa di Saccharomyces Cerevisiae mediante cromatografia liquida accoppiata con spettrometria di massa tandem

I protocolli descrivono metodi di cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiati all'indice di rifrazione o al rilevamento spettrometrico di massa per lo studio delle reazioni metaboliche in complessi sistemi privi di cellule a base di lisato.

Cromatografia liquida accoppiata all'indice di rifrazione o al rilevamento spettrometrico di massa per la profilazione dei metaboliti in sistemi privi di cellule a base di lisato

Abbiamo costruito un flusso di lavoro metabolomico non mirato che integrava XY-Meta e metaX insieme. In questo protocollo, abbiamo mostrato come utilizzare XY-Meta per generare una libreria spettrale esca dal riferimento spettrale ad accesso aperto, quindi eseguito il controllo FDR e utilizzato il metaX per quantificare i metaboliti dopo aver identificato gli spettri di metabolomica.

Un flusso di lavoro integrato di identificazione e quantificazione sul metaboloma non mirato basato sul controllo FDR

Questo protocollo mira a preservare i metaboliti cellulari per la spettrometria di massa a singola cellula (SCMS) combinando il lavaggio con soluzione salina volatile, l'estinzione rapida dell'azoto liquido, la liofilizzazione e lo stoccaggio a -8 °C. Dimostra che l'estinzione dell'azoto liquido è essenziale per mantenere i profili dei metaboliti, mentre la conservazione prolungata del freddo dovrebbe essere ridotta al minimo per prevenire alterazioni metaboliche.

Preparazione del campione per la spettrometria di massa a singola cellula Studi di metabolomica: lavaggio, tempra, essiccazione e conservazione combinati delle cellule

Scopri la metabolomica one-step per analizzare carboidrati, acidi organici e aminoacidi con GC/MS in un'unica procedura. Questo metodo migliora lo screening neonatale per errori congeniti del metabolismo.

One-step Metabolomica: carboidrati, acidi organici e aminoacidi quantificati in una procedura unica

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