Escape Response Assay: un metodo per studiare la risposta della larva di zebrafish agli stimoli tattili

- Per iniziare, trasferisci delicatamente alcuni embrioni in una capsula di Petri contenente terreno embrionale. Ora tieni il corion con una pinza e fai uno strappo con un'altra pinza.

Quindi, spingi delicatamente l'embrione attraverso la lacrima. La rimozione del corion dall'embrione ne accelera la crescita e il movimento. Per eliminare i detriti, trasferire gli embrioni in un'altra capsula di Petri contenente terreno embrionale utilizzando una pipetta Pasteur.

Metti la capsula di Petri in un'incubatrice e lascia che gli embrioni crescano a 28 gradi Celsius. Impostare un tavolino da microscopio illuminato riempito d'acqua a 28 gradi Celsius prima dell'esperimento per evitare deviazioni legate alla temperatura nel comportamento larvale.

Posiziona la piastra di Petri sul tavolino e montala nella fotocamera sopra la piastra. Quindi, centra l'embrione nel campo visivo della fotocamera. Ora tocca delicatamente l'embrione con un ago smussato e registra la risposta larvale sul software di registrazione della videocamera.

Su stimolo, l'embrione mostra una potente risposta di fuga: una nuotata a raffica insieme a curve strette. Misura il tempo che intercorre tra il tocco e il picco di accelerazione delle larve durante la sua fuga.

Nel protocollo di esempio, osserveremo la risposta delle larve di zebrafish agli stimoli esterni.

- Per eseguire il test, posizionare una capsula di Petri riempita con circa 25 millilitri di terreno embrionale su un tavolino illuminato a temperatura controllata impostato a circa 28 gradi Celsius. Montare la telecamera ad alta velocità sopra la parabola. Avvia il software di registrazione video e imposta la velocità di acquisizione su 1.000 fotogrammi al secondo per garantire che sia possibile acquisire velocità di nuoto elevate.

Posizionare l'embrione al centro della capsula di Petri, ben visibile nel campo visivo. Premi il tasto di registrazione e poi eroga uno stimolo meccanosensoriale toccando delicatamente l'embrione con un ago smussato sulla parte superiore della testa.

Interrompere la registrazione una volta che l'embrione è uscito dal campo visivo o è tornato a riposare.

- Test ripetuti delle stesse larve possono portare all'assuefazione o promuovere la debolezza muscolare in alcuni modelli di malattia, con conseguente riduzione della risposta allo stimolo tattile. Pertanto, ogni embrione dovrebbe essere testato una sola volta.