Screening della tossicità chimica basata sugli embrioni: valutazione degli effetti sullo sviluppo di embrioni di zebrafish

- Iniziare aggiungendo 5 embrioni in terreno E3 a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti e rimuovere il terreno in eccesso con una pipetta. Aggiungere un terreno E3 contenente kanamicina in ogni pozzetto per prevenire la contaminazione. Lascia che gli embrioni crescano a 28 gradi Celsius.

Diluire il composto di interesse con un solvente appropriato, come il DMSO, per preparare diverse concentrazioni o dosi e testare l'effetto di ciascuna dose sugli embrioni in via di sviluppo. Una volta che gli embrioni raggiungono lo stadio desiderato, pipettare ogni soluzione madre in pozzetti individuali. Copri il piatto con un coperchio e agitalo delicatamente per amalgamare il contenuto. Lascia che gli embrioni nella piastra a pozzetti crescano a 28 gradi Celsius.

Al momento desiderato nello sviluppo embrionale, posizionare la piastra a pozzetti sotto un microscopio adatto per esaminare il fenotipo degli embrioni. È possibile osservare fenotipi come la perdita degli occhi, la crescita ritardata o la perdita di melanociti negli embrioni in via di sviluppo. Nel seguente protocollo, testeremo una libreria di composti per inibitori di piccole molecole dello sviluppo del prosencefalo.

- Le librerie di piccole molecole sono tipicamente fornite in una piastra sorgente a 96 pozzetti con ogni composto immagazzinato in DMSO come un stock da 10 millimolari. Circa 60 minuti prima che gli embrioni raggiungano lo stadio desiderato, scongelare un numero appropriato di piastre da 96 pozzetti contenenti aliquote di piccole molecole. Prendere nota del numero di serie o di altro numero di identificazione delle targhette di origine. Per ridurre al minimo la condensa sulle piastre, scongelare in una camera di essiccazione contenente drierite.

Far girare brevemente le piastre in una centrifuga da tavolo dotata di un adattatore per piastre a più pozzetti. Rimuovere il nastro sigillante in alluminio dalla piastra di origine. Utilizzando una pipetta a 12 canali, diluire i composti nella piastra sorgente alla concentrazione desiderata con DMSO. In questo protocollo, utilizziamo una concentrazione finale di 0,5 millimolari e aggiungiamo 4,75 microlitri di DMSO per diluire la piastra madre da 10 millimolari.

Quando gli embrioni nella piastra a 96 pozzetti raggiungono lo stadio desiderato, utilizzare una pipetta a 12 canali per trasferire 2,5 microlitri di composti dalle piastre di origine alle piastre riceventi contenenti gli embrioni. Coprire le piastre che ora contengono gli embrioni e i composti con i coperchi e annotare il numero di identificazione delle piastre di partenza sulle piastre per embrioni. Mescolare i piatti facendo roteare delicatamente e metterli in un'incubatrice a 28,5 gradi Celsius. Coprire ogni piastra di origine contenente piccole molecole inutilizzate con nastro sigillante di alluminio e metterla in un congelatore a meno 80 gradi Celsius per la conservazione a lungo termine.

Prima di eseguire la schermata visiva, formulare un criterio di hit specifico. Ad esempio, in uno screening per inibitori di piccole molecole dello sviluppo del prosencefalo, un colpo può essere un composto che conferisce la perdita del proencefalo. L'assenza di occhi è un facile indicatore visivo della perdita del prosencefalo e non richiede fluorescenza per essere dosata.

Nei momenti desiderati dello sviluppo, rimuovere dall'incubatrice le piastre da 96 pozzetti contenenti embrioni trattati con composti ed esaminare ogni pozzetto con uno stereomicroscopio. Durante lo screening per gli inibitori di piccole molecole dello sviluppo del prosencefalo, esaminare le piastre a 28 ore per la perdita dell'occhio come marcatore dell'inibizione dello sviluppo del prosencefalo. Registrare l'identità della piastra e l'ubicazione del pozzetto per ogni pozzetto in cui almeno 3 embrioni su 5 presentano il fenotipo di hit prescritto.

Riposizionare la piastra a 96 pozzetti nell'incubatore. Riconfermare la perdita degli occhi e del proencefalo a 48 ore. Anche se gli embrioni non avranno un proencefalo, sopravviveranno fino ad almeno quattro giorni. Riconferma un potenziale successo testando nuovamente gli effetti del composto a diverse dosi. Per ogni dose, 10 embrioni vengono testati in 0,5 millilitri di terreno E3 in un formato di piastra a 48 pozzetti.

La tempistica dell'aggiunta del composto per la ripetizione del test deve essere identica a quella dello screening originale. Un hit è confermato quando il fenotipo suscitato viene riprodotto in modo dose-dipendente dopo aver ripetuto il test del composto. Infine, identificare il composto colpito dal database di piccole molecole nella libreria chimica.