Elettrofisiologia del Patch Clamp a cellula intera: un metodo per studiare le proprietà elettriche dei neuroni

- Iniziare posizionando su un tavolino da microscopio una camera di registrazione contenente un campione in una soluzione da bagno, la cui composizione corrisponde all'ambiente extracellulare fisiologico o al citoplasma. Far avanzare la micropipetta di registrazione, una pipetta contenente un elettrodo d'argento immerso in una soluzione elettrolitica, che imita le condizioni intracellulari, verso il neurone applicando una pressione positiva, e fare contatto con la membrana cellulare.

Passare delicatamente dalla pressione positiva a quella negativa per formare una tenuta ermetica tra la membrana e la pipetta. Impostare un potenziale di mantenimento sull'amplificatore per mantenere la cella a una tensione costante. Quindi rompere la membrana cellulare all'interno della micropipetta applicando l'aspirazione.

Una volta che la membrana cellulare si rompe, il potenziale di tenuta provoca il flusso di ioni attraverso canali ionici voltaggio-dipendenti, creando un potenziale di membrana, che viene registrato dall'elettrodo di registrazione. Registrare immediatamente il potenziale di membrana. L'elettrodo di registrazione trasmette il segnale all'amplificatore di retroazione, che sottrae il potenziale di membrana dal potenziale di mantenimento: un oscilloscopio, che presenta una visualizzazione visiva del potenziale di membrana, e un computer. Nel seguente protocollo, eseguiremo una misurazione del patch clamp sulla cellula di Mauthner in un embrione di zebrafish.

- Per prepararsi al bloccaggio dei patch, iniziare tirando alcune pipette patch clamp con vetro borosilicato a parete sottile in un estrattore orizzontale. I diametri della punta della pipetta sono di circa 0,2-0,4 micrometri dopo la lucidatura a fuoco fino a un bordo liscio e la conicità del gambo è lunga circa 4 millimetri.

Riempire il puntale della pipetta con la soluzione intracellulare immergendo il puntale nel liquido intracellulare. Quindi inserire un ago per siringa nella pipetta ed espellere delicatamente la soluzione intracellulare dalla siringa per completare il riempimento della pipetta. Collegare la pipetta allo stadio della testa dell'amplificatore nella configurazione di elettrofisiologia. È importante mantenere lo stadio della testa a un angolo di circa 45 gradi rispetto all'asse orizzontale, in quanto ciò garantisce un angolo di ingresso della pipetta adatto alla formazione di guarnizioni ad alta resistenza con la cella di Mauthner.

Poco prima che la pipetta si abbassi nella soluzione del bagno, applicare una piccola quantità di pressione positiva sulla pipetta per ridurre la possibilità di blocco del puntale. Continuare ad avvicinarsi alla cellula M con una piccola quantità di pressione positiva nella pipetta. La pressione positiva spinge delicatamente la cellula da un lato all'altro e, quando viene posizionata immediatamente sopra la cellula, forma una piccola fossetta sulla membrana cellulare.

A questo punto, lasciare la pipetta in posizione per alcuni secondi per pulire delicatamente la superficie cellulare in modo da formare una forte tenuta tra la pipetta e la membrana. Quindi rilasciare la pressione positiva nella pipetta per avviare la sigillatura. Una piccola quantità di pressione negativa, unita a un potenziale di pipetta negativo, provoca la formazione di guarnizioni giga-ohm in pochi secondi.

Successivamente, modificare il potenziale di tenuta nell'amplificatore a meno 60 millivolt. Rompere la membrana cellulare con una serie di brevi impulsi di aspirazione. Quindi registrare immediatamente i potenziali di membrana e ridurre al minimo gli artefatti di capacità. Compensa la capacità della cella e la resistenza di accesso dal 70% all'85%.

La resistenza di accesso deve essere monitorata ogni 30 secondi o un minuto e, se si verifica una variazione del 20% o più, interrompere l'esperimento. Una volta terminato l'esperimento e acquisiti dati sufficienti, sacrificare l'embrione rimuovendo il rombencefalo con un paio di pinze.