JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologia
0 visualizzazioni • 2:05 min • April 30th, 2023
- Per prima cosa, posiziona un pesce anestetizzato con il lato dorsale rivolto verso l'alto in una spugna pre-bagnata. Prima dell'elettroporazione, iniettare materiale genetico nel tessuto bersaglio, in questo caso una parte del proencefalo chiamata telencefalo. Quindi, metti una piccola quantità di gel per ultrasuoni sulla testa. Inoltre, applicare il gel sulla punta degli elettrodi per facilitare un funzionamento efficiente. Posizionare l'elettrodo positivo sul lato ventrale della testa e l'elettrodo negativo sul lato dorsale.
A questo punto, premere delicatamente gli elettrodi contro la testa e somministrare diversi impulsi di corrente elettrica. La corrente crea pori temporanei nella membrana plasmatica delle celle elettroporate e le rende permeabili. La corrente facilita anche il movimento di particelle caricate negativamente, come i plasmidi di espressione del DNA o gli oligonucleotidi RNAi presenti nell'ambiente circostante, nelle cellule. Nell'esempio seguente, utilizzeremo l'elettroporazione per introdurre un plasmide ricombinante nelle cellule ependimogliali, cellule staminali responsabili della generazione di nuovi neuroni.
- Copri il telencefalo di pesce con una piccola quantità di gel per ultrasuoni. Per l'elettroporazione dell'animale iniettato con plasmide, rimuovere la spugna dal set di espulsione e immergere il lato interno delle punte degli elettrodi nel gel per ultrasuoni. Posizionare la testa del pesce tra gli elettrodi, con l'elettrodo positivo sul lato ventrale della testa e l'elettrodo negativo sul lato dorsale. Quindi, tenendo ancora il corpo del pesce nella spugna, premere delicatamente e con precisione gli elettrodi contro il telencefalo e somministrare la corrente con il pedale, tenendo gli elettrodi in posizione fino al termine di tutti e cinque gli impulsi.