0 visualizzazioni • 2:47 min. • April 30th, 2023
- Trasferisci un pesce anestetizzato con tricaina su una spugna bagnata con il lato dorsale rivolto verso l'alto. Metti la spugna che trasporta il pesce al microscopio. Posizionare un ago per microiniezione a un angolo di 45 gradi rispetto all'asse del corpo vicino al muscolo dorsale.
Successivamente, individua il punto davanti alla pinna dorsale che non è coperto da squame dove puoi inserire l'ago senza applicare grande forza. Quindi inserire delicatamente l'ago e iniettare lentamente il composto di interesse insieme a un pennarello come il rosso fenolo nel muscolo.
Se il composto di interesse contiene materiale genetico, elettroporare le cellule posizionando elettrodi su entrambi i lati del sito di iniezione e somministrando la corrente. La corrente rende le cellule muscolari permeabili e in grado di assorbire in modo efficiente il materiale genetico. Dopo la procedura, trasferire immediatamente il pesce in una vasca di recupero. Nel seguente protocollo, eseguiremo un'iniezione intramuscolare su un pesce zebra adulto per somministrare un vaccino a DNA contro la micobatteriosi.
Per mantenere il pesce in una posizione fissa durante l'iniezione, utilizzare un pezzo di spugna con una scanalatura tagliata al centro come imbottitura. Immergere accuratamente la spugna nell'acqua di sistema e metterla in una capsula di Petri. Usando un cucchiaio di plastica, trasferisci un pesce zebra anestetizzato nella spugna bagnata con il lato ventrale del pesce rivolto verso il basso nella scanalatura. Al microscopio, posizionare l'ago con un angolo di 45 gradi vicino al muscolo dorsale del pesce zebra. Quindi trova la piccola macchia senza squame davanti alla pinna dorsale e spingi l'ago nel muscolo.
Se si avverte resistenza, provare un punto adiacente. Utilizzare un interruttore a pedale per iniettare gradualmente la soluzione plasmidica nel muscolo. Al microscopio, il rosso fenolo dovrebbe essere visibile quando entra nel tessuto muscolare.
Elettroporare il pesce immediatamente dopo l'iniezione posizionando gli elettrodi del tipo a pinzetta su ciascun lato del sito di iniezione. Premere il pulsante Start sull'elettroporatore e dargli sei impulsi da 40 volt e 50 millisecondi. Quindi trasferire delicatamente il pesce in una vasca di recupero. Infine, dopo aver anestetizzato il pesce secondo il protocollo di testo, utilizzare una luce UV per vedere l'espressione di EGFP vicino al sito di iniezione.