Modello di cardiomiopatia del pesce zebra: cardiotossicità indotta da farmaci

- La cardiomiopatia è una condizione in cui il muscolo cardiaco si indebolisce e perde la capacità di pompare il sangue. Questa condizione può essere replicata nel pesce zebra. Innanzitutto, diluire una soluzione madre di un farmaco responsabile della cardiotossicità nella soluzione salina bilanciata di Hanks per preparare diverse concentrazioni di lavoro. Quindi, posizionare un pesce anestetizzato con tricaina, con il lato ventrale rivolto verso l'alto, su una spugna di tenuta al microscopio da dissezione. Posizionare l'ago tra le pinne pelviche con un angolo di 45 gradi rispetto all'orizzontale.

Ora spingi delicatamente l'ago da 1 a 2 millimetri nella cavità peritoneale e inietta lentamente la soluzione farmacologica. Attendere cinque secondi prima di estrarre l'ago per evitare che la soluzione fuoriesca. Trasferire immediatamente il pesce in una vasca pulita contenente acqua fresca del sistema. Registra il numero di pesci che muoiono ogni giorno a causa di grave cardiotossicità, danni al muscolo cardiaco. Il farmaco si lega ai recettori di morte presenti sulla membrana cellulare dei cardiomiociti e innesca l'apoptosi, con conseguente grave cardiotossicità.

Crea una curva di sopravvivenza, un grafico che mostra la probabilità di sopravvivenza nel tempo per ogni concentrazione di farmaco. Nell'esempio, inietteremo doxorubicina, o DOX, per indurre la cardiomiopatia in un pesce zebra adulto in due modi.

Prima di iniettare il pesce con DOX, digiunare il pesce per 24 ore. Quindi, raggruppa i pesci. Durante l'anestetizzazione, utilizzare una carta da filtro pulita per asciugare ogni pesce e misurarne il peso corporeo. Crea gruppi di pesci che siano tutti entro il 10% dello stesso peso corporeo in modo che ogni gruppo possa essere iniettato con la stessa dose di DOX. Successivamente, calcolare la concentrazione di lavoro di DOX per ciascun gruppo in modo che ogni gruppo venga iniettato con cinque microlitri di soluzione e riceva la stessa dose di DOX in base al peso corporeo.

Quindi, diluire lo stock di DOX in 1x HBSS. Mescolare la diluizione con un vortice e poi centrifugare la diluizione a impulsi per mantenerla compatta nel tubo. Per l'iniezione, preparare una piattaforma per l'iniezione. In una capsula di Petri da 100 millimetri pulita, posizionare una spugna. Con l'aiuto di un microscopio da dissezione, tagliare una cavità nella spugna per contenere un pesce, quattro centimetri di solito funzionano.

Quindi, su un ago calibro 34, collegare una microsiringa da 10 microlitri. Quindi, sciacquare l'ago con 1x HBSS per rimuovere eventuali bolle o blocchi dalla siringa e dal tubo. Ora, anestetizzare brevemente il pesce adulto con la tricaina. Quindi, immergere la spugna nell'acqua dell'embrione con tricaina e trasferire un pesce sulla spugna con l'addome rivolto verso l'alto per l'iniezione. Ora, iniettare intraperitonealmente la soluzione DOX inserendo rapidamente l'ago con un angolo di 45 gradi nella linea mediana tra le pinne pelviche a circa 1 o 2 millimetri di profondità.

Quindi, rilasciare lentamente tutta la soluzione DOX. Prima di ritrarre l'ago, attendere cinque secondi. In alternativa, il pesce può essere posizionato lateralmente con l'interno a destra. Quindi, iniettato la linea laterale sopra la pinna pelvica con lo smusso rivolto verso le 7 a un angolo di 45 gradi e da 3 a 4 millimetri di profondità. Se uno dei due metodi di iniezione ha avuto successo, ci sarà una tinta rossa nella pancia.

Dopo l'iniezione, trasferire rapidamente il pesce in una vasca di attraversamento pulita riempita con acqua fresca del sistema dove può riprendersi. Quindi, sciacquare l'ago con HBSS e procedere all'iniezione del pesce successivo. Successivamente, rimettere il pesce iniettato in un sistema con circolazione in funzione ma separato dal sistema principale per evitare contaminazioni incrociate. Per le prossime 24 ore, continuare a digiunare il pesce. Durante la prima settimana, dopo l'iniezione, assicurati di controllare il pesce ogni giorno e di rimuovere eventuali pesci morti.