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0 visualizzazioni • 3:19 min • April 30th, 2023
Il lentivirus è un retrovirus che contiene materiale genetico a RNA. Questo virus fornisce un metodo efficiente e stabile per introdurre transgeni nelle linee cellulari tumorali. Inizia aggiungendo la neuraminidasi a una provetta contenente Lentivirus che esprime la proteina fluorescente verde, o GFP. Mantieni la provetta a 37 gradi Celsius per un'ora per aumentare l'efficienza di legame del virus.
Quindi, centrifugare una provetta contenente una sospensione di cellule tumorali per formare un pellet. Aggiungere un terreno mammostatico contenente polibrene per risospendere le cellule. Il polibrene è un polimero cationico che aumenta l'efficienza dell'infezione lentivirale. Ora piastra il numero ottimale di cellule tumorali per pozzetto in una piastra di coltura tissutale a sei pozzetti. Aggiungere la quantità necessaria di Lentivirus in ciascun pozzetto della piastra di coltura.
Agitare la piastra per mescolare il contenuto e mantenerla a 37 gradi Celsius per 96 ore con un apporto continuo di anidride carbonica. Il Lentivirus entra nella cellula e rilascia RNA. La trascrittasi inversa virale converte l'RNA in DNA a doppio filamento che si integra nel genoma ospite. Posizionare la piastra sotto un microscopio a fluorescenza e monitorare le cellule per verificarne la corretta trasduzione. Le cellule trasdotte diventano fluorescenti a causa dell'espressione di GFP.
Nel protocollo di esempio, eseguiremo la trasduzione di cellule tumorali dissociate da PDX con vettori lentivirali.
Per trasdurre le cellule tumorali, centrifugare le cellule isolate per la risospensione in due millilitri di terreno mammosferico. Dopo il conteggio, centrifugare nuovamente le cellule e risospendere il pellet in due millilitri di terreno mammosfera, integrato con 20 microlitri di polibrene. Successivamente, piastra 2 volte 10 alla quinta cellula tumorale vitale per pozzetto in una piastra di coltura tissutale a sei pozzetti a bassissima aderenza e particelle lentivirali alle cellule con una molteplicità di infezione di 10.
Agitare la piastra per mescolare il virus con le cellule e incubare le co-colture a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per un massimo di 96 ore, aggiungendo 500 microlitri di terreno mammoferico fresco dopo le prime 24 ore. Quando almeno il 10% delle cellule è positivo alla GFP, trasferire le cellule trasdotte da almeno un pozzetto in una provetta conica da 15 millilitri su ghiaccio e lavare il pozzetto con un millilitro di terreno mammosferico.
Raggruppare il lavaggio con le cellule e centrifugare le cellule tumorali in 10 millilitri di HBSS più HEPES. Infine, risospendere le cellule in 50 microlitri di estratto di matrice basale su ghiaccio e caricare le cellule incorporate in una siringa da insulina da 0,5 millilitri per il reimpianto.