Saggio di formazione di colonie di agar morbido: un metodo per testare gli effetti di nuovi composti sulla proliferazione delle cellule tumorali

Per iniziare, prendi una concentrazione appropriata di agarosio fuso in una provetta conica e aggiungi la quantità desiderata di terreno di coltura caldo. Capovolgere delicatamente per amalgamare il contenuto. Aggiungere questa miscela in ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti e lasciarla solidificare. Questo è lo strato inferiore. Successivamente, trattare le cellule tumorali con il composto di interesse e aggiungere la concentrazione richiesta di agarosio.

Ora, versa questa miscela contenente il numero desiderato di cellule per millilitro in ogni pozzetto. Questo è un livello contenente celle. Una volta che il terreno si è solidificato, incubare la piastra a 37 gradi Celsius per una settimana. Preparare uno strato di alimentazione mescolando l'agarosio al terreno e integrare questa miscela con il composto di interesse. Aggiungere delicatamente questo strato di alimentazione in ogni pozzetto, lasciarlo solidificare e incubare la piastra a 37 gradi Celsius.

Ripeti questa procedura di alimentazione settimanalmente per reintegrare le cellule con il terreno fino a formare colonie. Se il composto di interesse è un inibitore della tumorigenicità, sopprimerà la crescita cellulare con conseguente presenza di poche colonie nei pozzetti. Nel seguente protocollo, eseguiremo un saggio di formazione di colonie di agar morbido per studiare l'effetto degli inibitori PADI sulla tumorigenicità delle cellule di cancro al seno.

Iniziare questa procedura preparando il 3% di 2-idrossietilagarosio. In una bottiglia di vetro da 100 millilitri pulita e asciutta, aggiungere 0,9 grammi di 2-idrossietilagarosio seguiti da 30 millilitri di acqua distillata. Cuocere il composto nel microonde per 15 secondi e agitare delicatamente. Ripetere questo passaggio fino a quando la polvere di agarosio non si scioglie completamente. Successivamente, sterilizzare in autoclave la soluzione contenente il flacone per 15 minuti.

Lasciare raffreddare la soluzione di agarosio a temperatura ambiente prima di un ulteriore utilizzo. Preriscaldare diverse pipette da cinque millilitri e 10 millilitri in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per evitare che l'agarosio si solidifichi nella pipetta durante la manipolazione. Allentare parzialmente il coperchio del flacone e cuocere nel microonde la soluzione preconfezionata di agarosio al 3% 2-idrossietilagarosio per 15 secondi. Quindi agitare delicatamente la soluzione e cuocere nel microonde per altri 15 secondi.

Prestare attenzione quando si fa roteare la soluzione di agarosio perché la soluzione sale quando esposta all'aria e può fuoriuscire. Se c'è del gel solido residuo nel flacone, scaldare nel microonde per qualche secondo in più. Conservare il flacone contenente la soluzione di agarosio in un bagno d'acqua a 45 gradi Celsius durante i passaggi successivi per evitare che la soluzione di agarosio si solidifichi prematuramente.

Quindi, trasferire 12 millilitri di terreno riscaldato utilizzando le pipette preriscaldate in una provetta conica sterile da 50 millilitri. Aggiungere immediatamente tre millilitri della soluzione di agarosio al 3% e capovolgere delicatamente il tubo conico per mescolare l'agarosio con il terreno. Quindi aggiungere delicatamente due millilitri di questa miscela in ciascun pozzetto di una piastra di coltura a sei pozzetti senza formare bolle d'aria. Incubare la piastra di coltura a sei pozzetti orizzontalmente su una superficie piana a quattro gradi Celsius per un'ora per consentire alla miscela di solidificarsi.

Dopo che il composto si è solidificato, posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Lo strato inferiore è ora pronto per l'uso.

Un aspetto difficile di questa procedura è assicurarsi che tutte le cellule siano distribuite equamente e che il gel di agarosio fuso non si solidifichi prima dell'aggiunta a ciascun pozzetto, per garantire che le cellule vengano miscelate nel terreno prima di aggiungere il gel di agarosio liquido. Inoltre, le pipette vengono preriscaldate in anticipo per evitare che le soluzioni si solidizzino durante la manipolazione.

Per preparare lo strato contenente la cellula, tripsinizzare prima MCF10DCIS cellule e diluirle a una concentrazione di 40.000 cellule per millilitro. Quindi prelevare otto millilitri di terreno utilizzando pipette preriscaldate e trasferirli in una provetta conica sterile da 50 millilitri. Aggiungere immediatamente due millilitri di agarosio al 3% al tubo conico e capovolgere delicatamente per mescolare l'agarosio con il terreno. Evitare la formazione di bolle.

Successivamente, prelevare due millilitri di cellule e trattarle con due micromolari BB-cloro-ammidina in DMSO, o DMSO da solo come controllo. Dopo il trattamento, mescolare le cellule con un agarosio allo 0,6% in una diluizione uno a uno per ottenere una concentrazione finale di un micromolare BB-cloro-ammidina. Quindi prelevare un millilitro della miscela di cellule e agarosio e aggiungerla delicatamente allo strato inferiore della piastra di coltura a sei pozzetti.

Posizionare la piastra di coltura a sei pozzetti orizzontalmente su una superficie piana a quattro gradi Celsius per almeno 15 minuti per consentire allo strato superiore di solidificarsi. Dopo che la miscela si è solidificata, posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per una settimana prima di aggiungere lo strato di alimentazione. Iniziare la preparazione delle galline ovaiole alimentando nel microonde la soluzione preconfezionata di agarosio al 3% 2-idrossietil come prima ed equilibrando il flacone della soluzione di agarosio in un bagnomaria a 45 gradi Celsius.

Mescolare un millilitro di soluzione di agarosio al 3% con nove millilitri di terreno caldo in un tubo conico da 50 millilitri e capovolgere delicatamente per mescolare l'agarosio con il terreno. Evitare la formazione di bolle d'aria. Dopo aver trattato la miscela con BB-cloro-ammidina, aggiungere delicatamente un millilitro di miscela in ciascun pozzetto della piastra di coltura a sei pozzetti contenente il fondo e gli strati morbidi. Quindi posizionare la piastra di coltura a sei pozzetti orizzontalmente su una superficie piana a quattro gradi Celsius per almeno 15 minuti per consentire alla miscela di solidificarsi.

Dopo che lo strato di alimentazione si è solidificato, posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius. Ripetere questa procedura di alimentazione settimanalmente sovrapponendo un millilitro di soluzione di trattamento al terreno di agarosio allo 0,3% sullo strato di alimentazione esistente per rifornire le cellule con nuovi terreni fino a quando non si osserva la formazione di colonie.