Decellularizzazione dei cuscinetti adiposi mammari: derivazione di idrogel di matrice extracellulare dai cuscinetti adiposi mammari

Innanzitutto, posizionare i cuscinetti adiposi mammari o MFP in un piatto con una soluzione di tripsina-EDTA e incubare per la durata desiderata per rompere le aderenze della matrice cellulare. Lavare le stampanti multifunzione con acqua deionizzata e filtrarle con un colino. Mettere i fazzoletti in un becher con una barra di agitazione e aggiungere Triton X-100. Mescolare per lisare le cellule senza influenzare i fattori di crescita nella matrice extracellulare del tessuto.

Filtrare le unità multifunzione e sciacquarle con acqua deionizzata. Trasferire nuovamente i tessuti nel becher e aggiungere acido desossicolico per lisare le cellule rimanenti. Quindi, filtrare le MFP e metterle in un becher contenente acqua deionizzata con penicillina-streptomicina per prevenire la contaminazione. Incubare il becher a 4 gradi Celsius durante la notte.

Filtrare le MFP e metterle in un becher contenente etanolo e acido peracetico. L'acido peracetico aumenta la rigidità della matrice extracellulare del tessuto. Mescolate per un po' di tempo e ripetete il passaggio filtrante. Lavare le MFP con PBS e poi con acqua deionizzata. Trasferire le MFP filtrate in un becher contenente propano-1-olo.

Mescolare per un po' di tempo, filtrare il contenuto e lavare le stampanti multifunzione con acqua deionizzata. Asciugare le stampanti multifunzione e conservarle a meno 80 gradi Celsius. Nel seguente protocollo, eseguiremo la decellularizzazione dei cuscinetti adiposi mammari murini.

Per prima cosa, posizionare le MFP in piatti da sei centimetri con cinque millilitri di soluzione di tripsina-EDTA. Spruzzare e pulire le stoviglie con etanolo al 70% e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora. Utilizzare filtri da 0,7 millimetri per lavare le stampanti multifunzione con acqua deionizzata versando acqua sul tessuto tre volte. Usa una pinza per massaggiare manualmente il tessuto tra un lavaggio e l'altro.

Quindi, asciugare brevemente il fazzoletto su una salvietta delicata e pesarlo. Porre i fazzoletti essiccati in un becher pre-autoclavato contenente un'ancoretta di dimensioni adeguate e coprire i fazzoletti con 60 millilitri di t-ottilfenossi polietossietanolo al 3% per grammo di tessuto. Mescolate per un'ora a temperatura ambiente. Quindi, versare il contenuto dei bicchieri in un colino.

Sciacquare il becher con acqua deionizzata e versarla sui fazzoletti. Ripeti questo processo di risciacquo altre due volte, assicurandoti di utilizzare una pinza per massaggiare manualmente il tessuto tra un risciacquo e l'altro. Successivamente, asciugare brevemente il fazzoletto con una salvietta delicata e pesare. Riposizionare i fazzoletti e le ancorette negli stessi becher e coprirli con 60 millilitri di acido desossicolico al 4% per grammo di tessuto. Mescolare a temperatura ambiente per un'ora.

Quindi, versa il contenuto del becher in un colino a rete. Sciacquare il becher con acqua deionizzata e versarla sui fazzoletti. Ripeti questo processo di risciacquo altre due volte, assicurandoti di utilizzare una pinza per massaggiare manualmente il tessuto tra un risciacquo e l'altro. Asciugare brevemente il fazzoletto risciacquato con una salvietta delicata e pesarlo.

Metti i fazzoletti essiccati nello stesso becher insieme ad acqua fresca deionizzata integrata con streptomicina di penicillina all'1%. Coprire bene il bicchiere con pellicola di paraffina e lasciare a 4 gradi Celsius per una notte. Il giorno successivo, scolare il contenuto del bicchiere in un colino. Asciugare brevemente il fazzoletto con un panno delicato e pesarlo. Quindi, posizionare le stampanti multifunzione nello stesso bicchiere con un'ancoretta di dimensioni adeguate.

Coprire il tessuto con 60 millilitri di una soluzione contenente il 4% di etanolo e lo 0,1% di acido peracetico per grammo di tessuto. Mescolate a temperatura ambiente per due ore. Versare il contenuto del becher in un colino da 0,7 millimetri. Utilizzare una pinza per massaggiare manualmente il fazzoletto e riposizionare il contenuto nel becher. Lavare il fazzoletto coprendolo con 60 millilitri di 1X PBS per grammo di tessuto.

Mescolate a temperatura ambiente per 15 minuti. Ripetere l'intero processo di lavaggio ancora una volta. Quindi, versare il contenuto del becher in un colino da 0,7 millimetri. Usando una pinza, massaggiare manualmente il fazzoletto e riposizionare il contenuto nel becher. Lavare il fazzoletto coprendolo con 60 millilitri di acqua deionizzata per grammo di tessuto.

Mescolate a temperatura ambiente per 15 minuti. Ripetere l'intero processo di lavaggio ancora una volta. Asciugare brevemente il fazzoletto lavato su una salvietta delicata e pesarlo. Versare il tessuto e il contenuto in un colino e utilizzare una pinza per massaggiare manualmente il tessuto. Rimettere il contenuto nel becher e coprire i fazzoletti con 60 millilitri di n-propanolo al 100% per grammo di tessuto.

Mescolare a temperatura ambiente per un'ora. Quindi, asciugare brevemente il fazzoletto su una salvietta delicata e pesarlo. Versare il tessuto e il contenuto in un colino da 0,7 millimetri e utilizzare una pinza per massaggiare manualmente il tessuto. Rimetti il contenuto nel becher e lava il fazzoletto coprendolo con 60 millilitri di acqua deionizzata per grammo di tessuto.

Mescolate a temperatura ambiente per 15 minuti. Ripetere questo processo di lavaggio tre volte. Successivamente, asciugare brevemente il fazzoletto su una salvietta delicata e pesarlo. Trasferire il fazzoletto in una provetta da 15 millilitri etichettata e congelare a meno 80 gradi Celsius durante la notte.