Saggio di immunofluorescenza CTC: una tecnica per caratterizzare le cellule tumorali circolanti

0 visualizzazioni4:05 min • April 30th, 2023

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- Per iniziare, diluire le cellule tumorali circolanti isolate o CTC alla concentrazione richiesta utilizzando una soluzione anti-legame che protegge le cellule dal taglio dei liquidi e dai danni da pressione. Quindi, assemblare un vetrino da microscopio rivestito in polilisina e una scheda filtrante per citocentrifuga in un gruppo imbuto per citocentrifuga. Trasferire la sospensione cellulare nella porta dell'imbuto dell'assemblaggio, seguita dalla citocentrifugazione.

La forza centrifuga concentra e deposita un monostrato di cellule su un'area circolare del vetrino. Isolare l'area depositata con le cellule utilizzando un isolatore in silicone. Una volta asciutte, fissare le cellule utilizzando la paraformaldeide. Successivamente, incubare le cellule con una soluzione bloccante adatta contenente proteine che si legano facilmente a qualsiasi sito di legame non specifico sulla superficie cellulare.

Ora, etichettare le cellule con una soluzione di anticorpi marcati con fluorescenza di interesse. Gli anticorpi marcati con fluorofori riconoscono e si legano a specifiche molecole bersaglio sulla superficie cellulare. Lavare il campione per rimuovere eventuali anticorpi non legati. Aggiungere una soluzione di montaggio per preparare il campione per l'imaging.

Utilizzare un microscopio a fluorescenza per rilevare la luce emessa dai coniugati anticorpo-fluoroforo legati agli antigeni bersaglio sulle CTC. In questo protocollo, eseguiremo un saggio di immunofluorescenza delle CTC in campioni di pazienti con carcinoma polmonare non a piccole cellule.

- Per la colorazione in immunofluorescenza, contare le cellule in un emocitometro e diluire il campione arricchito a 1 volte 10 fino alla quinta cellula per 100 microlitri di concentrazione di soluzione antilegante allo 0,2%. Quindi, utilizzare un batuffolo di cotone imbevuto di 50 microlitri di soluzione antilegante per inumidire il contorno della camera del campione e posizionare un vetrino in vetro di polilisina nella camera del campione.

Chiudere la camera e pipettare su e giù tre volte per rivestire il puntale della micropipetta con la soluzione legante prima di risospendere il campione negli ultimi 100 microlitri del surnatante. Trasferire la soluzione cellulare nella camera del campione e citocentrifugare il campione in una centrifuga dedicata a 400 rotazioni al minuto per 4 minuti a bassa accelerazione.

Al termine della centrifugazione, posizionare un isolatore di silicone intorno all'area di deposizione e lasciare asciugare il vetrino sotto una cabina di sicurezza microbiologica per due minuti. Quindi, fissare il campione di citospun con 100 microlitri di paraformaldeide al 4% per 10 minuti a temperatura ambiente, seguiti da tre lavaggi di 2 minuti con 200 microlitri di PBS per lavaggio a temperatura ambiente.

Dopo l'ultimo lavaggio, bloccare qualsiasi legame aspecifico con un'incubazione di 30 minuti nel reagente bloccante a temperatura ambiente seguita da marcatura con 100 microlitri della soluzione anticorpale di interesse. Posizionare il vetrino etichettato in una capsula di Petri da 100 x 15 millilitri su un pezzo di carta assorbente inumidito con 2 millilitri di acqua sterile e posizionare la capsula chiusa a 4 gradi Celsius durante la notte, al riparo dalla luce.

La mattina successiva lavare il campione tre volte con PBS come dimostrato e montare il campione con 10 microlitri di una soluzione di montaggio appropriata e un vetrino coprivetro. Quindi sigillare il vetrino coprioggetto con smalto trasparente.

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Ultimo aggiornamento: 1 agosto 2026