Inflazione dell'agarosio polmonare intero: un metodo per preparare i polmoni per l'imaging dal vivo ex vivo

- Per prima cosa, posiziona un topo soppresso su una tavola di dissezione. Proprio sopra l'addome, tagliare la pelle e il peritoneo. Forare il diaframma e tagliare lungo le costole e la gabbia toracica fino alla trachea. Crea una piccola incisione nella trachea. Inserire delicatamente un ago all'interno della trachea senza ferire la carena e fissarlo con una pinza. Iniettare l'agarosio a basso punto di fusione a temperatura corporea normale all'interno dei polmoni. Rimuovere lentamente la siringa e tenere l'ago all'interno per evitare il riflusso dell'agarosio.

Versare il PBS freddo sui polmoni per favorire la gelificazione dell'agarosio. Rimuovere l'ago e fissare la trachea con una pinza per evitare il riflusso dell'agarosio non solidificato. Taglia lo sterno, tieni la trachea con una pinza e tagliala con le forbici. Estrarre i polmoni dalla cavità toracica. Separare i lobi nel supporto. Posizionare all'interno dei pozzetti di imaging in condizioni fisiologiche per microscopia. L'agarosio preserva la morfologia polmonare a temperature fisiologiche che aiutano ad osservare le interazioni cellulari vive. Nel seguente protocollo, dimostreremo l'imaging dal vivo ex vivo dei polmoni per studiare le interazioni tra cellule tumorali e cellule stromali.

- Per preparare i polmoni per l'imaging dal vivo ex vivo, inizia immobilizzando il topo su un coperchio di polistirene espanso coperto con un pezzo di ammollo e sterilizza l'animale con etanolo al 70%. Successivamente, usando le forbici chirurgiche, praticare un'incisione epigastrica trasversale attraverso la pelle, seguita da un'incisione simile attraverso il peritoneo. Quindi, spostando la tavola di dissezione in posizione verticale, tagliare l'aorta discendente in modo che il sangue si accumuli nell'addome e non nella cavità toracica.

Tagliare una piccola apertura nel diaframma per rilasciare il vuoto, quindi tagliare lungo la gabbia toracica per asportare il diaframma e visualizzare i polmoni. Usando le forbici chirurgiche, taglia la pelle fino alla trachea sopra la gabbia toracica, lasciando intatte le costole. Quindi separare la pelle dalla gabbia toracica e rimuovere il tessuto connettivo circostante per esporre la trachea, facendo attenzione a non danneggiare la trachea stessa. Tagliare una piccola apertura di circa 1 millimetro di diametro nella trachea esposta parallelamente agli anelli cartilaginei il più vicino possibile alla laringe, senza tagliare completamente la trachea.

Quindi inserire delicatamente un ago calibro 20 da 4 a 5 millimetri nella trachea senza alcuna forza contraria. L'estremità dell'ago dovrebbe essere visibile attraverso la trachea. Riempire una siringa con 400 microlitri di agarosio a bassa temperatura di fusione a 37 gradi Celsius al 2%, quindi stabilizzare l'ago con una pinza. Mantenendo la tavola di dissezione verticale, instillare lentamente l'intera quantità di agarosio caldo attraverso l'ago nei polmoni. Una volta che i polmoni sono gonfiati, staccare la siringa mantenendo l'ago all'interno della trachea e versare circa 50 millilitri di PBS a 20 gradi Celsius sui polmoni per aiutare a fissare l'agarosio.

Quando l'agarosio si è solidificato, rimuovere l'ago e utilizzare una pinza per chiudere la trachea per evitare la fuoriuscita di agarosio non solidificato. Ora, apri ulteriormente il torace con la sternotomia e afferra la trachea con una pinza. Quindi, usando un paio di forbici chirurgiche, taglia completamente la trachea. Per rimuovere i polmoni, tirare delicatamente la trachea verso l'alto, tagliare il tessuto connettivo e l'esofago ed estrarre completamente i polmoni dalla cavità toracica.

Immergere il fazzoletto in 37 gradi Celsius RPMI 1640 per lavare via il sangue in eccesso. Usando forbici e pinze, taglia il bronco principale dello stelo dei lobi all'altezza dell'ilo e separa delicatamente i lobi polmonari. Trasferire i lobi in un pozzetto di una piastra ai fosfori a 24 pozzetti, con una superficie piana verso il basso e coprire il tessuto con 100 microlitri di 37 gradi Celsius RPMI 1640. Posizionare diversi vetrini di copertura per microscopio circolare da 15 millilitri sopra i lobi per evitare che galleggino e versare PBS caldo nei pozzetti circostanti per evitare che il terreno evapori. Quindi inserire la piastra a 24 pozzetti nella camera climatica e trasferire la camera al tavolino del microscopio confocale.