Co-coltura 3D di cellule tumorali del polmone con CAF: un sistema modello in vitro per studiare la progressione del tumore

- Nelle co-colture 3D, più tipi di cellule vengono cresciuti insieme in matrici come una matrice di membrana basale, che imita il microambiente naturale della matrice extracellulare, facilitando le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice. Per stabilire una co-coltura 3D incorporata, preparare una sospensione uniforme di fibroblasti associati al cancro o CAF e cellule tumorali del polmone prese in due è a un rapporto, nella matrice della membrana basale. Mantenere la sospensione sul ghiaccio per evitare la solidificazione della matrice a temperatura ambiente.

Trasferire un volume appropriato di sospensione in una piastra per colture cellulari. Incubare a 37 gradi Celsius per la durata richiesta per co-incorporare le cellule nella matrice. Per stabilire una co-coltura 3D sovrapposta, preparare una sospensione di cellule tumorali polmonari nella matrice della membrana basale, nella densità cellulare desiderata. Mantenere le sospensioni sul ghiaccio. Pipettare un volume appropriato di questa sospensione di matrice cellulare in una piastra di coltura cellulare. Incubare a 37 gradi Celsius per impostare la monocoltura di cellule tumorali incorporata.

Successivamente trasferire il volume desiderato di CAF sospesi nei terreni di coltura preferiti, sopra le cellule tumorali incorporate. Nelle co-colture 3D, i CAF migliorano la formazione di sferoidi delle cellule tumorali e attirano le cellule tumorali, dando luogo a strutture a forma di lacrima. In questo protocollo, co-coltiveremo cellule di cancro del polmone TUM622 e CAF per studiare la loro interazione.

- Dopo aver preparato le sospensioni cellulari di TUM622 e CAF, come descritto in precedenza, contare la densità cellulare CAF mescolando 10 microlitri di sospensione cellulare con 10 microlitri di blu di tripano. Aggiungere 10 microlitri della miscela a ciascuna delle due camere di un emocitometro per contare e calcolare la densità cellulare. Per co-incorporare le cellule TUM622 e i CAF nella matrice della membrana basale, calcolare prima il numero desiderato di celle utilizzate per la placcatura, in base alle informazioni sulla densità cellulare. I CAF vengono seminati con un rapporto di 2 a 1 delle cellule TUM622. Trasferire il volume calcolato di TUM622, così come la sospensione di cellule CAF, nella stessa provetta da centrifuga. Centrifugare e aspirare tutto il substrato. Risospendere nella matrice della membrana basale e nella piastra 310 microlitri della miscela in ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti. Per l'immunofluorescenza, trasferire 60 microlitri di miscele TUM622 e CAF su vetrini da camera come descritto in precedenza.

Per co-coltivare TUM622 con CAF sovrapposti nella matrice di membrana basale, impostare prima la monocoltura TUM622 come descritto in precedenza. Trasferire il doppio del numero di sospensioni di CAF in una provetta da centrifuga e centrifugare a 300 volte 'g' per cinque minuti a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante e risospendere i CAF in un millilitro di terreno di coltura 3D. Trasferire la sospensione di CAF da un millilitro nel pozzetto contenente le celle TUM622 incorporate.