Perché la determinazione dell'IC50 è fondamentale prima dell'aumento della dose?

La determinazione della concentrazione iniziale IC50 mediante saggio MTT fornisce la concentrazione di riferimento per avviare l'escalation del dosaggio a 1/10 dell'IC50, garantendo l'applicazione di una pressione selettiva senza citotossicità immediata. Ciò consente uno sviluppo graduale della resistenza nel tempo, piuttosto che una morte cellulare acuta.

In che modo l'output del saggio MTT informa lo sviluppo della resistenza?

Il saggio MTT misura la produzione di formazano derivante dall'attività della reduttasi mitocondriale nelle cellule vitali, in cui la densità ottica a 570 nm è correlata al numero di cellule; la resistenza viene confermata quando le cellule mantengono la vitalità a concentrazioni crescenti di afatinib che inizialmente inibivano la crescita.

Cosa permette la replicazione affidabile dello sviluppo di linee cellulari resistenti?

Un'escalation progressiva della dose in condizioni di subconfluenza, con aumenti di concentrazione del 10-20% ad ogni passaggio, fornisce un protocollo standardizzato di pressione selettiva che può essere riprodotto in diversi laboratori per generare modelli isogenici resistenti.

Perché i requisiti di replicazione sono essenziali per la collaborazione interfunzionale?

Uno sviluppo della resistenza coerente tra le repliche garantisce che i fenotipi osservati siano determinati geneticamente piuttosto che stocasticamente, consentendo un passaggio affidabile tra i team di scoperta, sviluppo dei saggi e preclinico per studi di validazione dell'obiettivo.

Quale analisi statistica è necessaria per confermare lo sviluppo della resistenza?

La resistenza viene confermata confrontando le curve di vitalità ottenute con il saggio MTT tra cellule parentali e cellule trattate con dosi crescenti, richiedendo un test di significatività statistica (ad esempio, analisi dello spostamento dell'IC50) per dimostrare una ridotta sensibilità al farmaco nel tempo.

Aumento della dose: un metodo per sviluppare la resistenza ai farmaci nelle cellule tumorali

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0 visualizzazioni • 4:17 min • April 30th, 2023

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- Gli inibitori della tirosin-chinasi, TKI, bloccano il legame del recettore chinasico con l'ATP, impedendo la fosforilazione. Inizia con la placcatura delle cellule tumorali nei terreni di crescita. Lasciare che raggiungano una densità favorevole e trasferire le cellule in più pozzetti. Dopo la crescita notturna, erogare diverse concentrazioni di farmaco in più pozzetti e lasciare che le cellule crescano per la durata desiderata. Aggiungere MTT, un colorante solubile in acqua, per misurare la vitalità cellulare. Gli enzimi mitocondriali convertono l'MTT in formazan viola insolubile all'interno delle cellule viventi.

Arrestare la reazione aggiungendo un agente solubilizzante adatto e misurare la formazan spettrofotometricamente. Questo metodo è chiamato saggio MTT. Tracciare un grafico delle cellule viventi indicate dal formazan rispetto alle concentrazioni di farmaci. Calcola la concentrazione inibitoria, IC₅₀, trovando la concentrazione del farmaco che uccide il 50% delle cellule utilizzando il software.

Successivamente, coltiva le cellule tumorali nel terreno di coltura e distribuiscile in tre diverse piastre. Dopo che le cellule hanno raggiunto la subconfluenza, aggiungere 1/10 di diluizione della concentrazione di IC₅₀. Lasciare che le cellule crescano ed eseguire il saggio MTT. Ripetere questo processo aumentando il dosaggio del farmaco. Le cellule cancerose sviluppano lentamente resistenza ai TKI a causa di mutazioni nella sequenza proteica.

Il seguente protocollo mostra lo sviluppo della resistenza ad afatinib nelle cellule PC9 mediante aumento della dose.

- Per determinare l'appropriata concentrazione di resistenza ad afatinib, coltivare cellule PC9 in terreno di crescita in una piastra trattata con coltura cellulare di 10 centimetri a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Risospendere le cellule PC9 a una concentrazione di 4 volte 10-4 cellule per millilitro di terreno di crescita e seminare le cellule a 50 microlitri di sospensione cellulare per pozzetto in una micropiastra da 96 pozzetti. Dopo un'incubazione notturna nell'incubatore per colture cellulari, trattare le cellule con 50 microlitri di soluzione di afatinib per pozzetto a sei repliche delle concentrazioni indicate. E dopo un'incubazione di 96 ore nell'incubatore per colture cellulari, aggiungere 15 microlitri di colorante MTT a ciascun pozzetto.

Dopo quattro ore nell'incubatore per colture cellulari, aggiungere 100 microlitri di soluzione di arresto della solubilizzazione in ciascun pozzetto e rimettere la piastra nell'incubatore per una notte. La mattina successiva, misurare la densità ottica a 570 nanometri su un lettore di micropiastre. Per l'esposizione continua ad afatinib, coltivare le cellule PC9 in piastre P100 contenenti 10 millilitri di terreno di crescita fino a quando le cellule non raggiungono la subconfluenza.

Trasferire le colture subconfluenti in tre nuove piastre P100 da 9 millilitri di terreno di crescita per piastra di coltura iniziale e rimettere le cellule nell'incubatore per colture cellulari. La mattina successiva, aggiungere 0,1 nanomolari o 1/10 della concentrazione inibitoria semimassima di afatinib a ciascuna serie di tre piastre di coltura. Quando le cellule trattate con afatinib diventano subconfluenti, utilizzare una pipetta da 1 millilitro per mescolare accuratamente le colture e trasferire 1 millilitro di cellule da ciascuna piastra a 9 millilitri di terreno di crescita fresco in nuove piastre P100.

Aggiungere concentrazioni più elevate di afatinib dal 10% al 20% alle nuove colture, aumentando la concentrazione di afatinib con un aumento graduale della dose ogni volta che le colture raggiungono la subconfluenza in un periodo di 10-12 mesi. Quando viene raggiunta una concentrazione di afatinib di 1 micromolare, eseguire il test MTT come dimostrato per confermare che le cellule hanno sviluppato resistenza ad afatinib.