Saggio di estrazione dell'RNA: un metodo per estrarre l'RNA dalle cellule tumorali del polmone trasfettate con miRNA

0 visualizzazioni5:38 min • April 30th, 2023

- Per iniziare, semina le cellule tumorali del polmone in una fiaschetta a T contenente terreno di coltura tissutale e lasciala crescere durante la notte. Quindi, sospendere il miRNA con un agente trasfettante in un mezzo di trasfezione. Rimuovere il terreno e aggiungere un mezzo di trasfezione che introdurrà il miRNA nelle cellule tumorali. Il miRNA è una molecola di RNA non codificante che si lega a una sequenza di mRNA complementare e blocca l'espressione genica. Incubare il pallone per la durata desiderata.

Successivamente, sostituire i terreni con terreni di coltura tissutale e far crescere durante la notte. Aggiungere tripsina per la dissociazione cellulare. Trasferire il composto in una provetta da centrifuga contenente PBS e centrifugarlo. Rimuovere il surnatante e aggiungere il tampone di lisi per lisare le cellule e aggiungere etanolo ultra puro per la precipitazione. Porre la miscela in una colonna di separazione per purificare l'acido nucleico e centrifugare.

Rimuovere il flusso e aggiungere un tampone di lavaggio per rimuovere la membrana cellulare lisata e centrifugare. Rimuovere il tampone di lavaggio e aggiungere DNasi con il tampone di digestione DNasi per rimuovere il DNA dal campione e centrifugare. Aggiungere il tampone di preparazione dell'RNA per isolare l'RNA e centrifugare. Raccogliere l'RNA presente nel surnatante. Nel seguente protocollo, eseguiremo l'estrazione dell'RNA da cellule tumorali del polmone trattate con miRNA.

- In primo luogo, seminare le cellule tumorali in un pallone appropriato sufficiente per l'estrazione di RNA e proteine per eseguire l'espressione genica utilizzando l'analisi qPCR o microarray. Quindi incubare per una notte con terreno integrato con il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina.

Il giorno successivo preparare il campione di microRNA per la trasfezione diluendo il microRNA 143 e il microRNA 506 nel terreno, a una concentrazione di 100 nanomolari ciascuno. Estrarre il pallone dall'incubatrice e rimuovere il supporto. Lavare con 1 x PBS.

Tutti i controlli non trattati conterranno solo terreni incompleti con celle. Incubare le cellule con mezzi di trasfezione per sei ore in un'incubatrice. Dopo sei ore, rimuovere il supporto e sostituirlo con 4 millilitri di supporto completo fresco. Raccogliere le cellule dopo 24 ore e 48 ore mediante tripsinizzazione.

Quindi lavare due volte con 1x PBS in ogni tubo e rimuovere il surnatante. Per eseguire l'estrazione dell'RNA in un secondo momento, congelare le cellule a meno 80 gradi Celsius.

- L'estrazione dell'RNA è stata eseguita utilizzando un kit di RNA, seguendo le istruzioni del produttore. Per prima cosa rimuovere i tubi da meno 80 gradi Celsius e lasciarli scongelare.

- Aggiungere 300 microlitri di tampone di lisi e pipettare su e giù per rompere la membrana cellulare. Aggiungere un volume uguale di etanolo ultra puro al 100%. Quindi mescolare bene e posizionare nella colonna di separazione. Centrifugare e rimuovere il flusso.

Aggiungere 400 microlitri di tampone di lavaggio e centrifugare per rimuovere il tampone. Aggiungere 5 microlitri di DNAsi I con 75 microlitri di tampone di digestione del DNA in ciascun campione e incubare per 15 minuti. Quindi lavare il campione con 400 microlitri di tampone di RNA per la preparazione.

Quindi lavare due volte con tampone di lavaggio RNA. Ora aggiungere acqua priva di nucleasi alla colonna, centrifugare e quindi raccogliere l'RNA. Misurare la concentrazione di RNA, in questa fase è possibile inviare 2 microgrammi di campione di RNA per il sequenziamento dell'RNA.

08:40

Genome-Wide Screen per le destinazioni miRNA utilizzo di target Biblioteca MISSION ID

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Ultimo aggiornamento: 29 agosto 2026