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Ricerca sul cancro
0 visualizzazioni • 3:34 min. • April 30th, 2023
- Un microRNA o miRNA è un piccolo RNA non codificante. Dopo la trasfezione o l'introduzione dell'mRNA in una cellula, forma un complesso proteico miRNA. Il complesso prende di mira e si lega a uno specifico mRNA e ne regola negativamente l'espressione, arrestando la progressione del ciclo cellulare.
Per iniziare l'analisi, aggiungere un fissativo disidratante adatto a una coltura raccolta di cellule di cancro del polmone trasfettate con miRNA. Il fissativo preserva le cellule e permealizza anche la membrana cellulare. Trattare le cellule con una miscela di ioduro di propidio, un colorante fluorescente dell'acido nucleico e l'enzima ribonucleasi.
Il colorante entra nelle cellule e colora sia il DNA che l'RNA. L'enzima degrada specificamente l'RNA consentendo una quantificazione ottimale del DNA. Utilizzare un citometro a flusso per determinare la percentuale di cellule arrestate in diverse fasi del ciclo cellulare in base all'intensità di fluorescenza delle singole cellule.
Le cellule in fase di riposo e di crescita hanno un contenuto di DNA inferiore e, quindi, una minore intensità di fluorescenza. Le cellule nella fase Gap 2 con il doppio della quantità di DNA producono il doppio dell'intensità della fluorescenza. Le cellule nella fase di sintesi del DNA inducono un valore di fluorescenza tra le altre due popolazioni. Il seguente protocollo analizzerà la regolazione del ciclo cellulare delle cellule di carcinoma polmonare trattate con miRNA misurando il loro contenuto di DNA mediante colorazione PI e citometria a flusso.
- Trasfetta le cellule come descritto nella sezione precedente di questo video. Raccogliere le cellule da ciascun campione in provette sterili separate da 15 millilitri mediante tripsinizzazione. Successivamente, lavare le cellule due volte con 1X PBS mediante centrifugazione a 751 g per 5 minuti e quindi rimuovere il surnatante. Risospendere e rompere il pellet aggiungendo 200 microlitri di PBS ghiacciato 1X attraverso il pipettaggio.
Aggiungere 2 millilitri di etanolo ghiacciato al 70% goccia a goccia nella provetta mentre si agita delicatamente la provetta per fissare le cellule. Incubare le provette per 30 minuti a temperatura ambiente e metterle a 4 gradi Celsius per 1 ora. Togliere le provette da 4 gradi Celsius e centrifugare.
Aggiungere 2 ml di PBS ghiacciato e vortex, quindi rimuovere il surnatante mediante centrifugazione. Aggiungere 500 microlitri di 1X PBS contenente ioduro di propidio e ribonucleasi A con concentrazioni rispettivamente di 50 e 200 microgrammi per millilitro in ciascun campione e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Trasferire i campioni in provette appropriate al riparo dalla luce ed eseguirli su citometro a flusso.