Perché il test dell'ipotesi nulla è importante per la citometria a flusso di PD-L1?

Il test dell'ipotesi nulla nella citometria a flusso per PD-L1 consente una valutazione oggettiva di eventuali differenze significative nell'espressione del marcatore tra gruppi sperimentali, supportando una valida conferma del bersaglio e riducendo i falsi positivi nella fase iniziale della scoperta.

In che modo l'isolamento della variabile indipendente si inserisce nei flussi di lavoro di sospensione delle cellule polmonari?

L'isolamento di variabili come la concentrazione dell'enzima e il tempo di incubazione garantisce che le variazioni nel rendimento cellulare o nell'espressione dei marcatori siano attribuibili alle condizioni sperimentali, migliorando la riproducibilità e l'interpretabilità nei percorsi di scoperta.

Cosa permettono le misurazioni quantitative mediante citometria a flusso nei modelli polmonari?

La citometria a flusso quantitativa fornisce dati precisi sulle popolazioni cellulari e sull'espressione dei marcatori, consentendo analisi comparative tra diverse condizioni e supportando decisioni basate sui dati nella ricerca in immunooncologia.

Perché i requisiti di replicazione sono fondamentali per i protocolli di preparazione delle cellule polmonari?

La replicazione garantisce che l'isolamento delle cellule e i risultati della citometria a flusso siano coerenti tra esperimenti e gruppi di lavoro, facilitando la collaborazione interfunzionale e un progresso affidabile dei programmi preclinici.

Quali capacità di analisi statistica sono necessarie prima di attuare studi citofluorometrici sul PD-L1?

È necessaria un'analisi statistica robusta per interpretare i dati di citometria a flusso, valutare il grado di significatività delle differenze nell'espressione dei marcatori e guidare le decisioni di avanzamento o interruzione nelle procedure di validazione degli obiettivi.

Preparazione del polmone di topo per citometria a flusso: generazione di sospensioni cellulari dal tessuto polmonare per l'analisi citofluorimetrica

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0 visualizzazioni • 3:48 min • April 30th, 2023

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- Inizia prendendo un topo soppresso e fissalo su una tavola di dissezione con del nastro adesivo. Usa le forbici per tagliare la pelle. Fai un'incisione verticale attraverso il diaframma e taglia le costole per raggiungere la cavità toracica esponendo il cuore e i polmoni. Quindi, fai una piccola incisione nel ventricolo sinistro del cuore. Successivamente, individuare il ventricolo destro e inserire una siringa contenente PBS nel lume del ventricolo. Perfondere la PBS attraverso il ventricolo destro lasciando fluire il sangue fuori dall'incisione preformata nel ventricolo sinistro fino a quando i polmoni diventano bianchi. Estrarre il tessuto polmonare contenente noduli tumorali e tritarlo in piccoli pezzi.

Incubare i pezzi nel tampone di digestione polmonare. La collagenasi nel tampone per la digestione polmonare aiuta a isolare le cellule e la DNAsi aiuta a eliminare il DNA dalle cellule morte. Filtrare la sospensione risultante attraverso un filtro cellulare per rimuovere i grumi e rendere uniforme la sospensione cellulare. Centrifugare e risospendere il pellet nel tampone cloruro di ammonio e potassio per lisare gli eritrociti residui. Centrifuga per raccogliere i globuli bianchi e le cellule tumorali nel pellet. Risospendere il pellet in PBS integrato con FCS, per mantenere la stabilità della cella. Nel seguente protocollo, dimostreremo la preparazione della sospensione di cellule polmonari per l'analisi citofluorimetrica.

Dopo l'endpoint sperimentale appropriato, immergere la carcassa in etanolo al 70% e fissare l'animale a una tavola di dissezione. Praticare un'incisione ventrale sulla linea mediana e invertire delicatamente la pelle per esporre i muscoli della parete toracica e gli organi addominali. Con le forbici forare il diaframma e tagliare le costole esponendo la cavità toracica. Tagliare una piccola apertura nel ventricolo sinistro e utilizzare un ago calibro 27 per perfondere il polmone tre volte attraverso il ventricolo destro con 6-8 millilitri di PBS ghiacciato per infusione. Dopo l'ultima perfusione, i polmoni dovrebbero essere completamente privi di sangue e apparire bianchi. Dopo il prelievo, usa le forbici per tritare il tessuto polmonare in piccoli pezzi.

Trasferire i frammenti polmonari in una provetta da microcentrifuga da 2 millilitri contenente 1,5 millilitri di tampone per la digestione polmonare per un'incubazione da 30 a 60 minuti a 37 gradi Celsius con agitazione. Al termine della digestione, trasferire la sospensione cellulare attraverso un colino cellulare da 70 micron in una provetta da 50 millilitri e utilizzare l'estremità di uno stantuffo a siringa sterile da 10 millilitri per premere eventuali frammenti di tessuto rimanenti attraverso il filtro. Sciacquare il colino con 15 millilitri di PBS integrato con FCS al 2% e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Risospendere il pellet in 1 millilitro di tampone di lisi di potassio cloruro di ammonio per un'incubazione di 5 minuti a temperatura ambiente e centrifugare nuovamente le cellule. Quindi risospendere il pellet di globuli bianchi in 1 millilitro di PBS integrato con FCS al 2% e colorare le cellule per l'analisi citofluorimetrica secondo il protocollo sperimentale.