Why does centrifugation temperature matter for plasma miRNA isolation?

Centrifugation at 4 degrees Celsius prevents cellular lysis and non-specific miRNA release from blood cells, preserving sample integrity for biomarker analysis.

How does proteinase K protect miRNA during extraction?

Proteinase K degrades proteins, including nucleases, that could otherwise digest RNA during downstream processing, ensuring miRNA stability.

What is the purpose of DNase 1 treatment in the protocol?

DNase 1 removes genomic DNA contamination from the sample, improving the specificity of miRNA purification for downstream applications.

Why must plasma be processed within one hour of collection?

Timely processing prevents ex vivo cellular changes and miRNA release or degradation, maintaining the fidelity of the circulating biomarker profile.

What storage condition preserves extracted miRNA integrity?

Storing the eluted miRNA at minus 80 degrees Celsius prevents RNA degradation and ensures suitability for longitudinal biomarker studies.

Estrazione dei miRNA: un metodo per estrarre i miRNA dal campione di plasma

JoVE Encyclopedia of Experiments

Ricerca sul cancro

0 visualizzazioni • 3:59 min • April 30th, 2023

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

- I microRNA, o miRNA, sono piccoli RNA non codificanti coinvolti nella regolazione genica. Le loro espressioni sono alterate durante il cancro e quindi sono potenziali biomarcatori del cancro. Per iniziare l'isolamento dei miRNA, prelevare un campione di sangue intero appena raccolto e centrifugare a 4 gradi Celsius per separare il plasma dalle cellule del sangue. Trasferire il surnatante in una nuova provetta e centrifugare nuovamente per ottenere un surnatante plasmatico più chiaro. Estrarre il surnatante, trattare con una soluzione di omogeneizzazione refrigerata, quindi con un tampone di lisi per omogeneizzare il campione. Aggiungere la soluzione dell'enzima proteinasi K per degradare le proteine, in particolare le nucleasi che altrimenti digeriscono l'RNA durante le fasi a valle.

- Quindi, caricare il lisato nell'apposito pozzetto di una cartuccia di estrattore di acidi nucleici specifica per lo strumento preassemblata. Aggiungere la soluzione di DNasi 1 al pozzetto appropriato per eliminare il DNA genomico dal campione. Aggiungere acqua priva di nucleasi al tubo di eluizione montato sulla cartuccia per il condizionamento prima dell'isolamento del miRNA. Caricare il gruppo cartuccia nell'estrattore di acido nucleico. Selezionare ed eseguire il software di purificazione dei miRNA appropriato. Al termine, rimuovere il tubo di eluizione contenente il miRNA e conservarlo a meno 80 gradi Celsius.

- Nel seguente protocollo, mostriamo l'estrazione di miRNA da campioni di sangue di pazienti per lo screening del cancro del polmone.

- Per iniziare questo protocollo, utilizzare provette vacutainer per raccogliere 10 millilitri di campione di sangue intero. Conservare a temperatura ambiente.

- Non conservare il sangue intero a bassa temperatura, ad esempio 4 gradi Celsius, per evitare shock termici e lisi cellulare che portano a un rilascio di microRNA non specifico.

- Centrifugare il plasma entro un'ora per separarlo. Assicurandosi di evitare il contatto con l'anello linfocitico, trasferire il surnatante in una provetta da 15 millilitri. Quindi centrifugare il surnatante alle stesse condizioni. Aliquotare 1 millilitro di questo surnatante plasmatico in crioviali da 1,5 millimetri, facendo attenzione a evitare di raccogliere la frazione di plasma dal fondo del tubo. Per iniziare l'isolamento dell'RNA, aggiungere 200 microlitri di soluzione OMG pre-raffreddata a 200 microlitri di plasma per ogni campione. Per garantire una completa omogeneizzazione, agitare per 15-30 secondi. Per omogeneizzare il campione, aggiungere 200 microlitri di tampone di lisi e 25 microlitri di proteinasi K per campione e agitare per 20 secondi.

- Quindi incubare i campioni a 37 gradi Celsius in un termomiscelatore per 15 minuti. Quindi, selezionare il metodo tissutale RSC miRNA e caricare una cartuccia per ogni campione su un vassoio di un estrattore automatico di acidi nucleici, posizionando correttamente lo stantuffo. Trasferire il lisato e aggiungere 5 microlitri di soluzione di DNasi 1 nelle posizioni appropriate nella cartuccia dello strumento. Alla base di ogni provetta di eluizione, aggiungere 60 microlitri di acqua priva di nucleasi. Per iniziare la purificazione automatica, avviare la corsa. Conservare i campioni di RNA totale a meno 80 gradi Celsius.