Colorazione immunoistochimica: un metodo per ottenere informazioni spaziali da sezioni sottili di tessuto

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- Inizia posizionando una sottile sezione di tessuto in una soluzione di ammoniaca per consentire un delicato recupero dell'antigene. Trasferire la sezione su un vetrino rivestito in polilisina. Le cellule caricate negativamente si legano alla polilisina caricata positivamente. Successivamente, aggiungi perossido di idrogeno per bloccare l'attività endogena della perossidasi. Lavare il vetrino in soluzione salina Tris-Buffered, TBS.

TBS promuove l'accesso degli anticorpi agli antigeni rompendo i legami incrociati delle proteine. Lavare la sezione con una soluzione a blocchi per ridurre il legame non specifico degli anticorpi. Aggiungere gli anticorpi primari alla sezione e incubare durante la notte. L'anticorpo primario si lega al suo antigene specifico presente sulla superficie cellulare. Lavare il vetrino con TBS.

Aggiungere anticorpi secondari coniugati con biotina che si legano alla regione Fc dell'anticorpo primario. Lavare la sezione con l'enzima streptavidina-biotina perossidasi. Quindi, aggiungere il substrato cromogenico della perossidasi al tessuto. La perossidasi converte il cromogeno in un prodotto colorato insolubile.

Controcolorare il tessuto con una soluzione di ematossilina. L'ematossilina si lega ai componenti acidi delle cellule e le trasforma in blu. Osservare il tessuto al microscopio ottico. Gli antigeni vengono rilevati come rossi mentre le cellule appaiono blu a causa dell'ematossilina. Nel seguente protocollo, eseguiremo la colorazione immunoistochimica per identificare le cellule CD45 e CD1a da biopsie endobronchiali.

- Prima di sezionare il tessuto bioptico incorporato, regolare attentamente il supporto del coltello nell'angolo del blocco per biopsia in modo che la lama poggi in piano contro la superficie del blocco. Quindi tagliare lentamente almeno due sezioni spesse 2 micron da ciascun campione di biopsia endobronchiale, utilizzando una pinza per trasferire ogni fetta di tessuto appena tagliata in una soluzione di ammoniaca allo 0,05% e acqua distillata. Dopo 45-90 secondi, utilizzare un vetrino da microscopio rivestito in poli-l-lisina per raccogliere ogni sezione aperta e lasciare asciugare le sezioni per almeno un'ora.

Quando le sezioni si sono asciugate, etichettare i vetrini come appropriato per l'esperimento e disegnare una barriera idrofobica attorno a ciascun campione. Successivamente, applicare 1 millilitro di soluzione di blocchi di perossidasi appena preparata sulle sezioni. Dopo 30 minuti, rimuovere la soluzione di blocco della perossidasi e quindi lavare le sezioni tre volte per cinque minuti con TBS, quindi rimuovere il TBS e aggiungere una soluzione bloccante BSA all'1% per un'altra incubazione di 30 minuti per bloccare qualsiasi legame anticorpale non specifico.

Al termine dell'incubazione, aggiungere l'anticorpo primario di interesse, diluito in TBS, e coprire i campioni per un'incubazione notturna a temperatura ambiente. La mattina successiva, lavare i vetrini tre volte in TBS e applicare l'anticorpo secondario di interesse per due ore a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, lavare i vetrini altre tre volte in TBS fresco e incubare i campioni in una soluzione di complesso streptavidina-biotina perossidasi appena preparata per due ore a temperatura ambiente, seguiti da altri tre lavaggi TBS.

Quindi trattare i piatti con una soluzione di substrato di perossidasi AEC appena preparata per 20-30 minuti. Quando si sviluppa l'intensità della macchia desiderata, sciacquare i vetrini in acqua corrente del rubinetto per cinque minuti e controcolorare le sezioni con la soluzione filtrata di ematossilina di Mayer. Dopo due minuti, lavare i vetrini in acqua corrente del rubinetto per altri cinque minuti, quindi scolare i vetrini e coprire le sezioni con un mezzo di montaggio acquoso permanente, asciugando i campioni in un forno di essiccazione a 80 gradi Celsius.

Dopo che si sono raffreddati, montare i campioni con il mezzo di montaggio DPX e un vetrino coprioggetto per la loro analisi a un ingrandimento di 40 volte su un microscopio ottico.

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Last updated: 18 July 2026