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Ricerca sul cancro
0 visualizzazioni • 5:08 min. • April 30th, 2023
- La terapia fotodinamica o PDT è un tipo di terapia della luce che utilizza fotosensibilizzanti, molecole attivate da luci di lunghezze d'onda specifiche. Un fotosensibilizzatore eccitato converte l'ossigeno molecolare presente nelle cellule in specie reattive dell'ossigeno che causano la morte cellulare. Per iniziare il saggio, preparare un sistema di somministrazione del farmaco basato su nanoparticelle desiderato che trasporta la concentrazione appropriata del fotosensibilizzatore, da solo o in combinazione con un farmaco di prova.
Aggiungere la concentrazione preferita di questa sospensione di nanoparticelle in una coltura di cellule tumorali del polmone. Incubare la coltura al buio per un tempo appropriato per facilitare l'assorbimento cellulare delle nanoparticelle. Sostituire la sospensione con il terreno di coltura desiderato. Successivamente, posizionare un laser a fibra per terapia fotodinamica sopra la coltura a una distanza ottimale che faciliti un'illuminazione uniforme. Irradiare le cellule a una lunghezza d'onda appropriata per il tempo desiderato e incubare durante la notte.
Sostituire il terreno con una soluzione adatta per la misurazione della citotossicità. Utilizzare un lettore di micropiastre per misurare la vitalità cellulare e quantificare gli effetti citotossici del trattamento sperimentale. Le cellule irradiate contenenti il fotosensibilizzante mostrano una ridotta vitalità. Nel seguente protocollo, eseguiremo un'analisi di fototossicità in vitro dell'ipocrellina B, un fotosensibilizzante, e del paclitaxel, un farmaco antitumorale, incapsulato in nanoparticelle di acido ialuronico-ceramide in cellule di cancro del polmone A549.
- Per iniziare, sintetizzare acido ialuronico-ceramide come descritto nel protocollo di testo allegato. Purificare il prodotto utilizzando una membrana per dialisi da 3,5 kilodalton e liofilizzarlo.
Successivamente, preparare le nanoparticelle di acido ialuronico-ceramide da sole, le nanoparticelle di acido ialuronico-ceramide insieme al fotosensibilizzatore e le nanoparticelle di acido ialuronico-ceramide con un agente antitumorale e il fotosensibilizzante.
Seminare la linea cellulare di cancro del polmone A549 nei pozzetti di una piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti a una densità di 1 volte 10 per la quinta cellula per pozzetto e incubare le cellule per 24 ore. Il giorno successivo, rimuovere il terreno e lavare le cellule con 1 millilitro di PBS.
Quindi sciogliere le nanoparticelle preparate in PBS fino a una concentrazione finale di 2 micromoli per millilitro del fotosensibilizzante, l'ipocrellina B, mediante vortex.
In quattro pozzetti ciascuno, aggiungere 1 millilitro di PBS, 1 millilitro di nanoparticelle vuote di acido ialuronico-ceramide, 1 millilitro di nanoparticelle contenenti il fotosensibilizzatore e 1 millilitro di nanoparticelle contenenti sia il fotosensibilizzante che il farmaco antitumorale.
Al termine, coprire la piastra e incubarla a 37 gradi Celsius per quattro ore al buio per consentire l'assorbimento delle nanoparticelle nelle cellule. Quindi rimuovere tutte le soluzioni e lavare le cellule aggiungendo 1 millilitro di PBS freddo.
Ripetere ancora una volta la fase di lavaggio, quindi aggiungere un terreno di coltura fresco. Quindi, posizionare la piastra di coltura a 24 pozzetti sotto una fibra per terapia fotodinamica e posizionare la fibra a 1 centimetro dal primo pozzetto.
- La distanza dalla fibra della terapia fotodinamica alle cellule è stato il fattore critico in questo studio. Era importante trovare la distanza ottimale che potesse coprire l'intera cella con la luce.
- Quindi indossa gli occhiali di sicurezza e spegni le luci. Illuminare le cellule con il laser al buio per un periodo compreso tra 5 e 40 secondi per attivare l'ossigeno singoletto altamente reattivo e altri radicali liberi nelle nanoparticelle contenenti fotosensibilizzatore.
Dopo l'esposizione alla luce, incubare le cellule al buio per 24 ore. Quindi, aspirare il terreno di coltura e lavare le cellule con 1 millilitro di PBS freddo. Ripetere ancora una volta la fase di lavaggio, quindi aggiungere 100 microlitri di terreno e 10 microlitri di soluzione per la misurazione della citotossicità in ciascun pozzetto.
Incubare le cellule nella soluzione per due ore al buio, quindi spostare tutti i campioni in una piastra a 96 pozzetti. Misurare l'assorbanza a 450 nanometri utilizzando un lettore di micropiastre.