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- Gli esosomi sono piccole vescicole legate alla membrana che trasportano biomolecole come lipidi, proteine, DNA, mRNA e microRNA. Gli esosomi vengono rilasciati da diversi tipi di cellule negli spazi extracellulari e possono essere isolati da biofluidi come il plasma.
Per iniziare, centrifugare il campione di plasma per rimuovere cellule e detriti. Trasferire il surnatante al plasma in una nuova provetta. Trattare il plasma con la concentrazione desiderata dell'enzima ribonucleasi. Incubare il campione su un blocco riscaldante a 37 gradi Celsius per una durata adeguata.
L'enzima degrada l'RNA libero nel campione, mentre l'RNA esosomiale rimane protetto. Diluire il campione utilizzando PBS. Quindi, aggiungere la concentrazione desiderata di soluzione enzimatica di proteinasi K e incubare a 37 gradi Celsius per un tempo appropriato. La proteinasi K degrada la maggior parte delle proteine plasmatiche. Inoltre, inattiva l'enzima ribonucleasi precedentemente aggiunto, eliminando così il rischio di degradazione dell'RNA esosomiale durante l'elaborazione a valle.
Aggiungere un volume adeguato di tampone di precipitazione degli esosomi per facilitare la separazione degli esosomi dal plasma. Centrifugare il campione per ottenere un pellet contenente esosomi intatti. Gli esosomi isolati trovano applicazioni nelle fasi a valle come l'estrazione di RNA e proteine.
Nel seguente protocollo, eseguiremo l'isolamento degli esosomi dal campione di plasma di pazienti con carcinoma polmonare non a piccole cellule.
- Per iniziare, scongelare un campione di plasma da 1 millilitro su ghiaccio. Una volta scongelato, capovolgere il tubo più volte per disaggregare eventuali crioprecipitati che potrebbero essersi formati. Quindi, centrifugare il plasma a 2.000 Gs per 20 minuti a temperatura ambiente, al fine di rimuovere cellule e detriti. Raccogliere il surnatante e centrifugare nuovamente il plasma, ora a 10.000 Gs per 20 minuti. Ancora una volta, raccogli il surnatante al plasma e ora aggiungi 10 microlitri di RNAsi. Incubare il plasma a 37 gradi Celsius per 10 minuti in un riscaldatore a blocchi termici.
- Abbiamo aggiunto una fase di trattamento con RNAsi al protocollo del kit standard per degradare i microRNA liberi. Successivamente, è stata sfruttata la fase di trattamento con la proteinasi K, inclusa nel protocollo del kit, al fine di degradare l'RNAsi e proteggere l'integrità dei microRNA esosomiali.
- Quindi, trasferisci il plasma in un nuovo tubo a metà volume di 1x PBS e fai vortice. Quindi, aggiungere 0,05 volumi di soluzione di proteinasi K, agitare nuovamente il campione e incubarlo a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Ora, aggiungere 0,2 volumi di tampone di precipitazione degli esosomi e mescolare il campione per inversione. Quindi, incubare il campione a quattro gradi Celsius per 30 minuti.
Dopo l'incubazione a freddo, centrifugare il campione a 10.000 Gs per cinque minuti a temperatura ambiente. Prelevare un'aliquota da 20 a 50 microlitri del surnatante e conservarla a scopo di controllo. Quindi aspirare e scartare il surnatante rimanente.
Risospendere il pellet di esosoma nel tampone di scelta, a un volume che dipende dall'analisi a valle. Per l'analisi dell'RNA, aggiungere un tampone di lisi specifico per l'estrazione dell'RNA.