3D DNA FISH: una tecnica per localizzare un gene specifico su un cromosoma

- Prendi un filo funzionalizzato con cellule attaccate sulla sua superficie e colorato mediante colorazione in immunofluorescenza. Lavalo con una soluzione salina ghiacciata, citrato di sodio o SSC. Posizionare il filo in un microtubo contenente sonde con tag fluorescenti e chiuderlo con un fermafilo. Incubare il microtubo in una camera umida e buia in un forno di ibridazione a 75 gradi Celsius per denaturare il DNA all'interno delle cellule.

Trasferire la camera in un forno a 37 gradi Celsius in modo che le sonde si leghino alla sequenza complementare sul DNA. Quindi, rimuovere la camera dal forno ed estrarre il filo. Immergere il filo in un tubo contenente una soluzione SSC alla temperatura desiderata. Lavare il filo con la soluzione SSC contenente Tween per rimuovere le sonde non specifiche o parzialmente ibridate e lavare nuovamente in acqua distillata.

Asciugare il filo e incubare la punta funzionalizzata in soluzione DAPI per colorare i nuclei della cellula. Sciacquare il filo con PBS e asciugare all'aria. Posizionare il filo sotto un microscopio a fluorescenza. La sonda ibridata con il gene di interesse appare come una macchia fluorescente nei nuclei della cellula. Nel seguente protocollo, eseguiremo 3D DNA FISH per determinare la traslocazione del gene ALK nelle cellule di cancro del polmone.

- 3 ore prima del protocollo DNA FISH, impostare il forno di ibridazione a 75 gradi Celsius e impostare il forno a calore secco a 37 gradi Celsius. Raffreddare la soluzione 0,4 volte di SSC a 4 gradi Celsius. Lavare il filo tre volte in una soluzione di SSC 0,4 volte ghiacciata. Asciugare il filo al buio sotto la cappa aspirante per 10 minuti.

Dopo 10 minuti, agitare e far girare la sonda per 5 secondi. Far cadere 10 microlitri di sonda in microprovette di vetro, quindi coprirle con pellicola da laboratorio. Avvolgere le microprovette in carta assorbente asciutta e inserirle in un tubo da 50 millilitri e girarle brevemente. Posizionare con cautela il filo asciugato nel microtubo e inserire il fermafilo. Quindi, sigillare il fermafilo con cemento di gomma.

Posizionare il filo in una camera umida e buia nel forno di ibridazione per 8 minuti a 75 gradi Celsius per ottenere la completa denaturazione del DNA. Dopo 8 minuti, spostare la camera umida in un forno a calore secco a 37 gradi Celsius per una notte. Mettere un barattolo per la colorazione dei vetrini con una soluzione di SSC 0,4 volte in un bagnomaria impostato a 72 gradi Celsius. Controllare la temperatura della soluzione SSC 0,4 volte fino a raggiungere 72 gradi Celsius più o meno.

Quindi, prepara due bicchieri di vetro: uno con SSC a due pieghe più una soluzione Tween allo 0,05% e il secondo con acqua distillata. Rimuovere la camera umida dal forno a calore secco. Utilizzare una pinzetta per rimuovere con cura il cemento di gomma dal tappo del filo e tirare l'estremità non rivestita del filo attraverso il tappo terminale, facendo attenzione a non danneggiare la punta funzionalzzata.

Immergere il filo nella soluzione di SSC 0,4 volte per 2 minuti a 72 gradi Celsius. Lavare il filo in SSC a due pieghe più una soluzione Tween allo 0,05% per 30 secondi a temperatura ambiente. Quindi, lavare il filo in acqua distillata a temperatura ambiente. Asciugare il filo sotto la cappa aspirante per 10 minuti al buio. Incubare la punta funzionalizzata del filo con la soluzione DAPI precedentemente preparata in un flaconcino da 2 millilitri. Sciacquare il filo due volte in PBS a 1 piega e asciugare il filo all'aria.

Posizionare il filo nel portafilo e inserire con cautela la punta funzionalizzata attraverso il punto di ingresso dell'apposito supporto fino a quando la punta non corrisponde al punto di aggancio. Posizionare il supporto speciale sul tavolino del microscopio. Regolare la messa a fuoco del microscopio utilizzando una lente da 20 pieghe. Innanzitutto, concentrati grossolanamente sul supporto speciale, quindi regola con precisione le celle che appaiono luminose nel canale DAPI.